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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
應(yīng)用RT-PCR及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)正常卵巢組織、卵巢上皮性良性腫瘤以及上皮性卵巢癌中LKB1和mTOR的表達(dá)情況,并分析二者的相關(guān)性及其與上皮性卵巢癌臨床病理因素間的關(guān)系,探討其在卵巢上皮性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制,從而為上皮性卵巢癌的早期診斷、分子靶向治療和預(yù)后判斷提供新的理論依據(jù)。
方法:
1、研究對(duì)象
選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的卵巢上皮性
2、腫瘤63例,包括卵巢上皮性良性腫瘤20例及上皮性卵巢癌43例。另取因其他疾病而手術(shù)切除的正常卵巢組織20例作為正常對(duì)照。全部患者術(shù)前均未接受放射治療和化學(xué)治療。
2、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)
提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,建立PCR反應(yīng)體系,95℃預(yù)變性8min,之后經(jīng)過(guò)變性95℃45s,退火55℃
3、或58℃35s,延伸72℃1min,38次或35次循環(huán)擴(kuò)增,再經(jīng)72℃7min,4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳120V,30min。采用凝膠分析軟件Gel Pro Analysizer3.1進(jìn)行定量,以目的基因與內(nèi)參基因的比值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。
3、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)
按照S-P免疫組化檢測(cè)試劑盒所示步驟檢測(cè)LKB1和mTOR蛋白的表達(dá),再經(jīng)
4、DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片,在顯微鏡下進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)設(shè)PBS代替(一)抗為空白對(duì)照,已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。
4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析
所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用行×列表資料的x2檢驗(yàn),兩兩比較采用分割法,指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān);計(jì)量資料采用單因素方差分析,用SNK法進(jìn)行兩兩比較,用直線相關(guān)分析各指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。檢驗(yàn)
5、水準(zhǔn)α=0.05,即P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1、卵巢上皮性腫瘤中LKB1的表達(dá)
1.1、LKB1 mRNA的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
正常卵巢組織和卵巢上皮性良性腫瘤中LKB1 mRNA表達(dá)水平分別為0.55±0.04和0.48±0.03,明顯高于上皮性卵巢癌,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但正常卵巢組織與卵巢上皮性良性腫瘤之間LKB1 mRNA表達(dá)量
6、的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LKB1 mRNA在臨床分期Ⅰ、Ⅱ期中的表達(dá)量顯著高于Ⅲ、Ⅳ期,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同組織學(xué)分級(jí)中,高、中分化組織的表達(dá)量(0.22±0.04)與低分化組織(0.04±0.01)之間差異有顯著性,P<0.05;在卵巢癌的不同病理類型及不同患病年齡組,LKB1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
1.2、LKB1蛋白的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
LKB1蛋白在卵巢
7、癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為30.2%(13/43),明顯低于正常卵巢組織90.0%(18/20)和良性腫瘤75.0%(15/20)(P<0.05)。卵巢癌患者LKB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、臨床分期有關(guān)(P<0.05),而與患者年齡、腫瘤病理類型無(wú)關(guān)(P>0.05)。
2、卵巢上皮性腫瘤中mTOR的表達(dá)
2.1、mTOR mRNA的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
正常卵巢組織和卵巢上皮性
8、良性腫瘤中mTOR mRNA表達(dá)水平分別為0.14±0.03和0.19±0.04,明顯低于上皮性卵巢癌,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。mTOR mRNA的表達(dá)水平在不同的年齡組及病理類型中的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而組織分化程度越低及臨床分期越晚,mTORmRNA的表達(dá)水平隨之增高,即低分化組明顯高于中高分化組,Ⅲ-Ⅳ期明顯高于Ⅰ-Ⅱ期,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.2、mTOR蛋白的表達(dá)及其與臨床
9、病理參數(shù)之間的關(guān)系
mTOR蛋白在上皮性卵巢癌中陽(yáng)性表達(dá)率為81.4%(35/43),明顯高于正常卵巢組織20.0%(4/20)和卵巢上皮性良性腫瘤40.0%(8/20)(P<0.05)。mTOR蛋白在低分化上皮性卵巢癌中的的陽(yáng)性表達(dá)率高于高-中分化癌組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);上皮性卵巢癌臨床分期越晚,mTOR表達(dá)越強(qiáng)(P<0.05);mTOR的陽(yáng)性表達(dá)率在不同患病年齡組及不同病理類型上皮性卵巢癌中不存在顯著差異(
10、P>0.05)。
3、LKB1和mTOR表達(dá)的相關(guān)性
3.1、LKB1和mTOR mRNA表達(dá)的相關(guān)性
在mRNA水平,LKB1與mTOR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.946,P=0.000,P<0.01)。
3.2、LKB1和mTOR蛋白表達(dá)的相關(guān)性
在免疫組化蛋白表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析表明LKB1與mTOR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.726,P=0.000,P<0.0
11、1)。
結(jié)論:
1、LKB1 mRNA在上皮性卵巢癌中的表達(dá)量明顯低于正常卵巢組織和卵巢上皮性良性腫瘤,說(shuō)明LKB1作為一種抑癌基因,其基因表達(dá)的缺失,可能促進(jìn)了上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展;而在上皮性卵巢癌組織中mTORmRNA則呈現(xiàn)出表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì),提示mTOR的過(guò)表達(dá)與上皮性卵巢癌的形成密切相關(guān)。
2、LKB1蛋白在上皮性卵巢癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率與其在正常卵巢組織和卵巢上皮性良性腫瘤組織中的陽(yáng)
12、性表達(dá)率相比呈下降趨勢(shì),提示LKB1在一定程度上能夠抑制上皮性卵巢癌的發(fā)生;在上皮性卵巢癌中mTOR蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于另外兩種組織,表明mTOR在卵巢腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中具有重要的作用。
3、在mRNA和蛋白水平,LKB1和mTOR均與上皮性卵巢癌的臨床分期、組織分化程度存在著密切關(guān)系,說(shuō)明了LKB1和mTOR可能參與了上皮性卵巢癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等,在上皮性卵巢癌的臨床診斷和判斷預(yù)后方面具有重要價(jià)值。
4
13、、研究結(jié)果顯示LKB1和mTOR的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),即在同一組織中,LKB1的表達(dá)水平隨著mTOR表達(dá)水平的升高而降低。提示二者在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著相反的作用,LKB1表達(dá)的缺失可能引起mTOR表達(dá)的上調(diào),共同促成了腫瘤的形成。
5、通過(guò)對(duì)LKB1和mTOR的研究,更加深入的了解上皮性卵巢癌的發(fā)病機(jī)制,為上皮性卵巢癌的早期診斷提供理論依據(jù),為卵巢癌的治療提供潛在的靶點(diǎn)及新的思路,從而改善卵巢癌患者的預(yù)后以及提
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