丁基苯酞對血管性癡呆大鼠記憶能力及海馬Bcl-2和Bax表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的：
　　 血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是指各種腦血管疾病引起的記憶和認(rèn)知功能損害綜合癥。VD已被廣泛認(rèn)為是65歲以上年齡組人群中僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的第二常見的癡呆類型。據(jù)統(tǒng)計(jì),65歲以上的人群中有6％至10％患有癡呆癥,而且這一比例隨著年齡增加而上升。在美國,VD患者在所有癡呆病例中的比例約為30％；雖然AD仍是癡呆的最常見類型,有近5百萬人,但

2、是有60％的AD病人很可能同時(shí)患有VD。據(jù)我國11個(gè)城鄉(xiāng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示:60歲以上老人中,VD的患病率為324/10萬人口,而AD為238/10萬人口,VD的患病率在各類癡呆中排第一位。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn),VD是目前為止唯一可以預(yù)防的癡呆類型,早期治療具有可逆性。不過目前在延緩VD病情發(fā)展、改善癥狀等方面現(xiàn)代醫(yī)學(xué)收效仍然有限。因此更深入地探究VD發(fā)病的相關(guān)危險(xiǎn)因素、發(fā)病機(jī)制、尋找新的早期診斷方法以及防治藥物,己成為神經(jīng)

3、病學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題之一。尤其開發(fā)有效防治VD的新藥顯得十分必要和緊迫。
　　 丁基苯酞(Butylphathlide,NBP)是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研發(fā)的新型抗腦缺血藥物,其對急性缺血性腦卒中具有顯著療效。2002年9月被國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準(zhǔn)為治療急性缺血性腦卒中的一類新藥。既往研究發(fā)現(xiàn),NBP能通過改善缺血區(qū)局部腦血流及缺血腦組織的能量代謝,減輕線粒體的損傷,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、自由基的產(chǎn)生、

4、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等來治療腦缺血。而VD有四個(gè)常見病理類型:大動脈腦梗塞引起的癡呆、小動脈腦梗塞引起的癡呆、再發(fā)性腦梗塞引起的癡呆和低灌注引起的癡呆。腦出血可能會導(dǎo)致VD,但多數(shù)學(xué)者不視其為一個(gè)病理類型。由此看來,VD與腦缺血密切相關(guān),而綜合以往實(shí)驗(yàn)研究證明丁基苯酞對缺血性腦卒中確有較強(qiáng)的治療作用,故大多數(shù)學(xué)者推測丁基苯酞對于VD應(yīng)有較好的治療效果,但尚缺乏直接的客觀基礎(chǔ)及臨床證據(jù),本課題正是利用行為學(xué)、病理形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)等多種方法對此

5、進(jìn)行了直接的相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)方面的研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.VD大鼠模型的制作
　　 選用健康成年雄性SD大鼠82只,采用Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)篩選,淘汰學(xué)習(xí)記憶能力差的大鼠。將合格大鼠稱重,排序,采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取9只為假手術(shù)組,其余用來制作VD模型。
　　 本研究采用雙側(cè)永久性頸總動脈結(jié)扎(Permanent bilateral common carotidartery occlus

6、ion,2VO)法制作VD動物模型。
　　 造模2月后,再次行水迷宮測試,每天4次,共5 d。記錄第5 d逃避潛伏期。以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期的均值作為參考值,計(jì)算模型組各鼠平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠平均潛伏期的比,該值大于20％作為模型鼠癡呆標(biāo)準(zhǔn)納入實(shí)驗(yàn)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)給藥
　　 將造模成功的VD大鼠按照各鼠逃避潛伏期的長短排序,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為:模型組、丁基苯酞治療組、尼莫地平治療組,每組9只

7、。另加上假手術(shù)組9只,共4組36只。
　　 造模2月后即灌胃給藥,各組均連續(xù)灌胃2個(gè)月。根據(jù)動物與人體體表面積折算法,藥物用量為人體用藥劑量的20倍。丁基苯酞采用石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的丁苯酞軟膠囊,生產(chǎn)批號為:09040211,預(yù)先在花生油中稀釋,制成濃度為20 mg/mL的溶液備用,按80 mg/kg每日灌胃,尼莫地平采用拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)的片劑,商品名尼膜同,研磨后先在花生油中稀釋,制成濃度為5 mg/mL的

8、溶液備用,按20 mg/kg每日灌胃。假手術(shù)組與模型組每日給予2 mL花生油灌胃。
　　 3.VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測
　　 各組均在灌胃2月后進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)檢測。記錄第5 d逃避潛伏期。
　　 4.病理標(biāo)本采集與制備
　　 各組大鼠水迷宮測試完畢后用10％水合氯醛腹腔注射麻醉,劑量為0.3mL/100 g,麻醉后立即開胸,使心臟暴露,將灌注針頭插入心尖,剪開右心耳使靜脈血完全放出,而

9、后夾閉腹主動脈,只灌注頭部、胸部及前肢。先灌注生理鹽水約100 mL；待老鼠兩前肢及兩肺變白改灌注4％多聚甲醛固定液約80 mL,此時(shí)可見大鼠頭頸及前肢明顯抖動,直至頸部及前肢僵硬即表明灌注充分,繼而斷頭取腦。再將腦置于4％多聚甲醛固定液中浸置4～6 h(4℃),而后取視交叉后2～6 mm至小腦前含海馬區(qū)的腦組縱用PBS漂沈,經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明后,浸蠟包埋。
　　 5.HE染色
　　 通過HE染色,光鏡觀察各組大

10、鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　 6.Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)染色
　　 應(yīng)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-perosidase,SP)進(jìn)行Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)染色,步驟如下:
　　 ①蠟塊5μm連續(xù)切片,撈片后放入烤箱,調(diào)至60℃烤12 h。
　　 ②脫蠟至水。
　　 ③滴加內(nèi)源性過氧化物酶封閉液,室溫孵育10 min,PBS充

11、分淋洗。
　　 ④熱抗原修復(fù)。
　　 ⑤滴加封閉用正常羊血清工作液,于室溫下孵育10min,甩干。
　　 ⑥滴加稀釋(稀釋比例均為1:100)過的兔抗鼠Bcl-2抗體、兔抗鼠Bax抗體,室溫下孵育4小時(shí),PBS液充分淋洗。
　　 ⑦滴加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗工作液,室溫下孵育10 min,PBS充分淋洗。
　　 ⑧滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的鏈霉親

12、和素,室溫下孵育10 min,PBS充分淋洗。
　　 ⑨加適量的3,3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloride,DAB)工作液,鏡下控染。
　　 ⑩蘇木素輕度復(fù)染,水化,以使細(xì)胞核顯示藍(lán)色,同胞質(zhì)中的DAB棕黃色形成對比。脫水,透明,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù),拍照。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)結(jié)

13、果均以(x)±s表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；方差不齊時(shí),多重比較用Welch檢驗(yàn),兩兩比較采用Games-Howell法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.一般狀況觀察:2VO術(shù)后,多數(shù)大鼠在1 h左右意識開始逐漸恢復(fù),但精神極度萎靡,只能爬行,反應(yīng)遲鈍,不思食水。術(shù)后24 h假手術(shù)組大鼠基本恢復(fù)正常飲食及行走,精神良好；造模大鼠仍然不能進(jìn)食,反應(yīng)亦較遲鈍,行走不

14、穩(wěn),部分大鼠仍只能爬行或轉(zhuǎn)圈。3～5天后造模大鼠進(jìn)食、精神、行走、反應(yīng)逐漸恢復(fù)正常。
　　 2.記憶能力測定結(jié)果:以大鼠逃避潛伏期代表記憶能力,逃避潛伏期越短,記憶能力越強(qiáng)。在給藥2個(gè)月后,各組大鼠逃避潛伏期差異有顯著性(F=26.104,P=0.000)。模型組、丁基苯酞治療組、尼莫地平治療組分別與假手術(shù)組比較大鼠逃避潛伏期皆顯著延長(P<0.05)；但丁基苯酞治療組、尼莫地平治療組分別與模型組比較均顯著縮短(P<0.05)；

15、而丁基苯酞治療組與尼莫地平治療組之間比較無顯著差異(P>0.05)。說明丁基苯酞能改善VD模型大鼠的記憶能力,且效果與尼莫地平相當(dāng)。
　　 3.各組大鼠形態(tài)學(xué)比較:光鏡下觀察,假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)則,胞質(zhì)豐富,胞核較大。模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元大量變性、死亡,細(xì)胞體積縮小,周圍出現(xiàn)空暈,胞漿濃縮、呈現(xiàn)深紅色染色,核固縮、碎裂明顯、深染。丁基苯酞治療組、尼莫地平治療組與模型組相比,海馬區(qū)神經(jīng)元變性、死亡明顯減輕。而丁基苯酞

16、、尼莫地平治療組之間比較無明顯差別。本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果表明丁基苯酞能改善VD大鼠海馬神經(jīng)元的病理形態(tài),且改善程度與尼莫地平相當(dāng)。
　　 4.免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果:在40×10倍光鏡下,每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)；以單個(gè)標(biāo)本為單位,取平均值。Bcl-2(抗凋亡蛋白)、Bax(促凋亡蛋白)免疫陽性細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均出現(xiàn)棕黃色顆粒(著色越深陽性反應(yīng)越強(qiáng))。假手術(shù)組海馬區(qū)有少量Bcl-2、Bax免疫陽性細(xì)胞,著色淺。模型組

17、較假手術(shù)組Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.05),著色增強(qiáng)；其中Bax增加更為顯著,故Bax/Bcl-2比值上升,細(xì)胞趨向凋亡。丁基苯酞治療組、尼莫地平治療組分別與模型組比較,Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增多(P<0.05),著色進(jìn)一步加深；而Bax陽性細(xì)胞數(shù)皆顯著減少(P<0.05)、著色變淺。丁基苯酞治療組與尼莫地平治療組之間比較無顯著差異(P>0.05)。提示丁基苯酞可以通過上調(diào)海馬Bcl-2和下調(diào)Bax蛋白表達(dá)來抑