基于Pyrosequencing技術(shù)的乙型肝炎病毒(HBV)耐藥變異檢測(cè)試劑盒性能評(píng)價(jià)和臨床試用.pdf

1、本研究分為兩部分:1、試劑盒性能評(píng)價(jià)①構(gòu)建包含十個(gè)常見已知的NAs相關(guān)耐藥變異標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,并用之對(duì)試劑盒性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。②兩種方法(雙脫氧測(cè)序法和焦磷酸測(cè)序法)檢測(cè)95份CHB患者血清,兩者結(jié)果不相符者進(jìn)行克隆測(cè)序法驗(yàn)證并對(duì)試劑盒性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。2、試劑盒臨床試用對(duì)119例急性乙肝患者感染乙型肝炎病毒多聚酶區(qū)(HBV RT)自然變異株檢測(cè)并分析。
　　 第一部分基于Pyrosequencing技術(shù)的乙型肝炎病毒(HBV)耐藥變異檢測(cè)試

2、劑盒性能評(píng)價(jià)
　　 目的：早期檢測(cè)到耐藥突變可以指導(dǎo)藥物的挽救治療。本研究的目的是評(píng)價(jià)基于Pyrosequencing(焦磷酸測(cè)序)技術(shù)的乙型肝炎病毒常見耐藥變異檢測(cè)試劑盒性能(靈敏度、特異性和可重復(fù)性等)。
　　 方法：1、構(gòu)建包含十個(gè)常見NAs相關(guān)耐藥變異位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,并對(duì)以上質(zhì)粒加以鑒定和定量。2、不同濃度、不同比例混合的質(zhì)粒樣本對(duì)試劑盒性能驗(yàn)證。3、服用NAs類藥物單藥或聯(lián)合治療治療應(yīng)答不良患者的慢性乙型肝炎患者

3、血清及未用過NAs藥物治療的CHB患者為研究對(duì)象,分別用雙脫氧測(cè)序法和焦磷酸測(cè)序法對(duì)患者感染HBV-DNA進(jìn)行序列分析,對(duì)兩種檢測(cè)結(jié)果不符合樣本再進(jìn)行TA-克隆測(cè)序法進(jìn)行分析,驗(yàn)證所開發(fā)研制的基于Pyrosequencing檢測(cè)平臺(tái)HBV耐藥突變檢測(cè)試劑盒的性能(靈敏度、特異性和可重復(fù)性等)。
　　 結(jié)果：1、獲得包含I169T、V173L、L180M、A181V、T184G、A194T、S202I、M204V、N236T、M2

4、50V等十個(gè)常見NAs相關(guān)耐藥變異位點(diǎn)序列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和A181T、M204I和野生型序列質(zhì)粒。通過PCR鑒定、酶切鑒定、雙脫氧測(cè)序和焦磷酸測(cè)序鑒定明確插入片段的系列與預(yù)期一致。2、試劑盒性能評(píng)價(jià)(敏感度、特異性和可重復(fù)性評(píng)價(jià))標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒梯度稀釋及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒不同濃度混合后使用試劑盒及臨床待檢血清進(jìn)行PCR擴(kuò)增、焦磷酸測(cè)序,結(jié)果顯示:1000copes/ml滴度水平以上的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及HBV-DNA1000copes/ml滴度水平以上HBV-DNA(

5、+)血清標(biāo)本均獲得了有效擴(kuò)增,陽性率達(dá)100％；擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序焦磷酸法測(cè)序結(jié)果與Sanger法測(cè)序結(jié)果的符合率為100％。在1000copes/ml滴度水平不同比例(野生型和突變型)混合的質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果:變異株質(zhì)粒占總質(zhì)粒≥10％時(shí)焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)出來陽性率達(dá)100％；在1000copes/ml滴度水平變異型質(zhì)粒占總質(zhì)粒10％使用試劑盒對(duì)分別進(jìn)行10—20次重復(fù)焦磷酸測(cè)序,其測(cè)序結(jié)果符合率為100％；焦磷酸測(cè)序法和直接測(cè)序法檢測(cè)我國

6、常見B基因和C基因型HBV病毒株感染的CHB患者血清標(biāo)本95例,對(duì)兩者結(jié)果符合率進(jìn)行分析,兩者完全符合率88.4％(84/95),同時(shí)評(píng)價(jià)所開發(fā)研制的基于Pyrosequencing檢測(cè)平臺(tái)HBV耐藥突變檢測(cè)試劑盒的性能。
　　 結(jié)論：所研發(fā)的基于焦磷酸測(cè)序法HBV耐藥突變檢測(cè)試劑盒可以特異性擴(kuò)增我國常見B基因和C基因型HBV病毒株,擴(kuò)增效率高,保證Pyrosequencing整個(gè)檢測(cè)體系的特異性與靈敏度。充分發(fā)揮Pyroseq

7、uencing技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,檢測(cè)位點(diǎn)靈活的特點(diǎn)。
　　 第二部分基于Pyrosequencing技術(shù)的HBV耐藥變異檢測(cè)試劑盒臨床試用-急性乙肝病毒感染者中核苷(酸)類似物相關(guān)耐藥準(zhǔn)種的檢測(cè)分析
　　 目的：了解急性乙型肝炎病毒感染者中HBV聚合酶區(qū)核苷(酸)類似藥物相關(guān)耐藥變異準(zhǔn)種的分布情況。
　　 方法：收集119例HBV DNA陽性急性乙型肝炎患者血清,分別采用巢式PCR產(chǎn)物直接測(cè)序、焦磷酸測(cè)序和T

8、A-克隆測(cè)序等方法對(duì)HBV聚合酶區(qū)(RT)與核苷(酸)類藥物耐藥相關(guān)的常見突變位點(diǎn)(rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250等)進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　 結(jié)果：PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢出感染HBV耐藥變異株患者6例(5.04％),分別為rtM204I1例、rtM204V2例以及rtA181V3例；焦磷酸測(cè)序法在上述6例病人的基礎(chǔ)上共檢測(cè)出9例耐藥準(zhǔn)種感染(r