SFTSV核酸檢測試劑盒國家參考品的研制和乙型腦炎病毒E蛋白的研究.pdf

1、第一部分發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核酸檢測試劑盒國家參考品的研制
　　【目的】發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒（SFTSV）是首次在中國出現(xiàn)并由國內(nèi)專家分離到的一種新病毒，病死率高達10％。目前針對該病毒尚無有效的疫苗和藥物。為了有效控制該疾病傳播，對其快速、準確診斷是基礎。市場上出現(xiàn)了各種檢測試劑盒，但尚無關(guān)于 SFTSV檢測試劑盒的相關(guān)標準品。為了對此類試劑盒等進行科學有效的質(zhì)量控制，本文研制了SFTSV核酸檢測試劑盒的

2、國家參考品。
　　【方法】本研究按照國家參考品建立的相關(guān)規(guī)定和 SFTSV的生物學特點，分別篩選出符合要求的陽性參考品和陰性參考品，并通過測序驗證和熒光定量PCR驗證進行確認，確保參考品的準確性和特異性。在此基礎上，將陽性參考品HB29株病毒系列稀釋，以此考察試劑盒的最低檢出限，從而確定參考品的靈敏度，并通過檢測稀釋至104U/mL的HB29株病毒Ct值的變異系數(shù)來確定參考品的精密度。本研究建立的參考品已組織不同實驗室進行協(xié)作標定

3、，以確定參考品的特性值。參考品完成之后進行不同溫度和反復凍融條件下的穩(wěn)定性實驗，考察參考品的穩(wěn)定性。
　　【結(jié)果】根據(jù)參考品應具有的廣譜性和代表性最終確定了6株陽性參考品和5株陰性參考品，基因測序和熒光定量 PCR驗證實驗均證明了參考品的準確性。通過對SFTSV HB29株病毒系列稀釋后的最低檢出限實驗，結(jié)合臨床上病人血清的病毒載量，確定102U/mL的病毒量作為參考品的最低檢出限，即含量為102U/mL必須檢測為陽性，低于102

4、U/mL不作要求。結(jié)合各個試劑盒的檢測結(jié)果，確定本精密度參考品的Ct值的變異系數(shù)應不高于5.0%。協(xié)作標定各實驗室結(jié)果均與本實驗室實驗結(jié)果一致。穩(wěn)定性實驗結(jié)果證明本參考品在不同溫度和反復凍融條件下穩(wěn)定性良好。目前本參考品已通過國家標準物質(zhì)委員會批準，作為 SFTSV核酸檢測試劑盒國家第一代參考品，其批準文號為：（2015）國生參字0065。
　　【結(jié)論】本研究建立了SFTSV核酸檢測試劑盒國家參考品，填補了國內(nèi)尚無SFTSV相關(guān)參

5、考品的空缺，能夠?qū)z測試劑盒進行良好的質(zhì)量控制，保證試劑盒能快速準確地檢測出病人血清中的SFTSV，從而更加科學有效的促進SFTSV的預防控制工作。
　　第二部分乙型腦炎病毒E蛋白的研究
　　【目的】乙型腦炎（JE）減毒活疫苗SA14-14-2是我國自主研發(fā)的一種疫苗，對乙腦的流行和控制起著重要作用，自投產(chǎn)以來在國內(nèi)外得到廣泛應用。為了從分子、原子水平探討乙型腦炎減毒株 SA14-14-2弱毒力穩(wěn)定、免疫原性良好的理論基礎，

6、解析JEV SA14-14-2蛋白中與病毒毒力和免疫原性相關(guān)的病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過原核表達獲得乙腦病毒E蛋白，通過X射線衍射技術(shù)，對該蛋白晶體進行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)合不同的乙腦病毒E蛋白的生物學功能，探索JEV SA14-14-2的免疫原性和減毒機理。
　　【方法】本研究將原核表達載體pQE C3與乙腦病毒E基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，驗證正確后導入到受體菌 BL21內(nèi)，以 IPTG誘導目的蛋白表達，高壓破碎細菌后收獲 E蛋白包涵體。再通過鎳柱親

7、和層析、折疊復性和凝膠過濾層析對表達的蛋白進行純化。獲得的目的蛋白一部分用于晶體結(jié)構(gòu)解析，另一部分以不同劑量（80μg/只、120μg/只）免疫 Balb/c小鼠，分別進行免疫攻擊保護力實驗和血清中和抗體檢測，以解析其生物學功能。
　　【結(jié)果】原核表達載體pQE C3與乙腦病毒包膜糖蛋白E基因連接完成，獲得了重組載體，轉(zhuǎn)化入表達菌BL21內(nèi)，并鑒定正確，獲得了陽性克隆。用 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導后收獲目的蛋白包涵體，經(jīng)過復性

8、、純化后獲得 JEV SA14-14-2、SA14-5-3、SA14-9-7 E蛋白，其中一部分蛋白用于E蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析，獲得了晶體。另一部分進行E蛋白免疫原性研究，結(jié)果顯示，SA14-14-2 E蛋白免疫后中和抗體水平最高，達1:23，血清陽轉(zhuǎn)率達100%。中和抗體水平和血清陽轉(zhuǎn)率高低趨勢均為 SA14-14-2>SA14-5-3>SA14-9-7，與三株病毒原型株的免疫原性高低趨勢相符。E蛋白保護力實驗結(jié)果顯示三組蛋白均呈現(xiàn)出一定

9、的保護力，但差異不明顯。
　　【結(jié)論】本研究通過原核表達收獲乙型腦炎病毒E蛋白，為深入研究該蛋白生物學功能和晶體結(jié)構(gòu)解析提供了條件，進一步為解析乙腦病毒的致病機理、乙腦減毒活疫苗毒株 SA14-14-2的減毒機理和疫苗的質(zhì)量控制奠定了技術(shù)基礎。SA14-14-2 E蛋白的中和抗體水平結(jié)果表明其蛋白的免疫原性高于SA14-5-3和SA14-9-7，這與三株病毒的免疫原性下降趨勢相符，推測E蛋白是影響乙腦病毒的免疫原性改變的關(guān)鍵蛋白。