乙型肝炎病毒X基因變異與cccDNA的檢測及臨床意義.pdf

1、背景：
　　乙型肝炎病毒(HBV)變異株是病毒基因堿基序列與同型的代表株或共有序列比較有獨特的變化。HBV的DNA多聚酶由于在DNA復(fù)制過程中缺乏校正功能,具有較高突變率。在慢性感染者中,HBV持續(xù)承受宿主巨大的免疫壓力,更易發(fā)生變異,但大多數(shù)變異并無實際意義;若變異發(fā)生在重要功能的區(qū)段內(nèi),影響了病毒蛋白質(zhì)的合成和結(jié)構(gòu),可使變異的病毒逃避免疫監(jiān)控,大量復(fù)制增殖,致病性增強,導(dǎo)致乙肝慢性化、重癥化及致癌化。既往重點對HBV基因組、P

2、基因區(qū)、前C及C區(qū)的變異研究,而位于HBV基因前C/C區(qū)上游約200bp左右的X區(qū)(nt1374-nt1838)是目前研究的熱點,其含有基本核心啟動子(Base Core Promoter,BCP)、核心上游調(diào)節(jié)序列(Core Upstream Regulation Sequences,CURS)、負性調(diào)節(jié)元件(Negative Regulation Element,NRE)、增強子Ⅱ(Enhancer,EnhⅡ)和直接重復(fù)序列(Dir

3、ect Repeatsequence,DR)1,2等重要的基因表達調(diào)控元件,編碼154個氨基酸殘基的X蛋白,具有廣泛的反式激活作用,在HBV的復(fù)制和表達中起重要作用。因此,據(jù)上述推測,HBVX基因變異對HBV復(fù)制及乙肝患者病程進展起著重要影響。
　　目的：
　　研究HBVX基因變異對HBV復(fù)制情況、乙肝患者病程進展、肝功能的影響及與HBV基因型的關(guān)系,為臨床治療乙肝患者及監(jiān)測病情進展提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　

4、　根據(jù)2005年病毒性肝炎防治方案診斷標準,將168例乙肝患者分為乙型肝炎攜帶者為29例,慢性乙型病毒性肝炎為70例,肝炎肝硬化31例,乙肝肝癌38例。所有入選患者以無菌操作取新鮮血液4ml。標本離心后分離血清置EP管,放入-70℃低溫冰箱保存。采用PCR-HRM分析技術(shù)檢測血清HBVX基因變異情況;直接測序(或克隆測序)確認變異位點;利用NCBI網(wǎng)站上的genotypetool確定HBV基因型;ELISA檢測HBV血清標志物;采用日立

5、7600型全自動生化分析儀檢測肝功能指標(ALT、AST、ALB及TBIL);放射免疫技術(shù)檢測肝纖維化指標(HA、LN、IV-C及PIIIP)。
　　結(jié)果：
　　1.采用PCR-HRM分析技術(shù)能很好地區(qū)分基因不同位點突變。168例乙肝患者血清HBVX區(qū)段突變檢出率前五位的位點是nt1764(72.6％)、nt1719(68.5%)、nt1762(67.8%)、nt1727(54.2%)、nt1726(37.5%)及nt173

6、0(37.5%)。
　　2.HBVX基因變異與血清肝臟功能指標無顯著性關(guān)系(p>0.05,t檢驗)。在HCC病例組里,BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異與層粘連蛋白(LN)之間差異有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。
　　3.HBeAg陰性組BCP雙變異(nt1762A→T/1764G→A)聯(lián)合CP聚集變異(nt1719T→C/1726A→C/1727A→T/1730C→G)、nt1755A-C/nt1768T-A雙變異的檢出率均顯著高

7、于HBeAg陽性組(p<0.05)。
　　4.HBVDNA高水平(105copies/ml≤HBVDNA)BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異、nt1755A-C/nt1768T-A雙變異的檢出率均顯著高于HBVDNA低水平組(103copies/ml≤HBVDNA<1×105copies/ml)(p<0.05)。
　　5.HBVC基因型中BCP雙變異、CP聚集變異、BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異及nt1755A-C/nt1768T-

8、A發(fā)生率均較B基因型高(p<0.05)。
　　6.BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異和nt1755A→C/nt1768A→G雙變異檢出率隨著乙肝病程進展有升高的趨勢,在乙肝肝癌組中檢出率最高。
　　結(jié)論：
　　1.PCR-HRM分析在HBV基因突變檢測中是一種較新的技術(shù),但此技術(shù)對所檢測樣本要求較高,可能影響其在臨床的廣泛使用。
　　2.nt1755A→C/nt1768A→G雙變異是除BCP雙變異外新的雙位點聯(lián)合突變。