玉米灌漿期胚乳發(fā)育分子調控分析.pdf

1、玉米為世界三大糧食作物之一，同時又是重要的飼料和工業(yè)原料。玉米籽粒胚乳是積累和貯藏營養(yǎng)物質的場所，占籽粒重量的80％以上，胚乳細胞的發(fā)育、增殖和充實情況決定了籽粒的重量和品質。然而胚乳發(fā)育是個相當復雜的生理生化過程，涉及了細胞的分裂和分化，器官的決定和形成，以及物質的轉移和積累等，其中物質的轉移和積累甚為重要。前人研究結果顯示轉錄因子、植物激素、甲基化等對胚乳發(fā)育具有重要的調控作用。同時前期部分研究也暗示microRNA(miRNA)可

2、能參與調控胚乳發(fā)育。灌漿期是物質的轉移和積累的關鍵時期，前期對玉米胚乳發(fā)育的調控也有部分研究，但在玉米灌漿期從轉錄和轉錄后水平對胚乳發(fā)育系統(tǒng)性的研究還鮮見報道。因此本文通過解析轉錄水平、轉錄后水平、表觀水平對灌漿期胚乳發(fā)育的調控，豐富我們對灌漿期胚乳發(fā)育所涉及的精細調控網(wǎng)絡的認識，更為深入細致地了解胚乳發(fā)育的調控機制。
　　本研究選用玉米自交系Mo17授粉后7天、9天、10天、11天、13天、15天、20天的胚乳為材料，通過轉錄組

3、測序、miRNA高通量測序、BS-seq，結合生物信息學分析方法，分析灌漿期胚乳發(fā)育過程中的遺傳調控網(wǎng)絡。并采用RT-PCR技術、酵母單雜交技術、瞬時表達技術進行實驗驗證。通過本研究，獲得以下研究結果:
　　(1)通過轉錄組測序，從7個玉米胚乳樣品中共檢測出的35915個基因至少在一個時間點表達，其中7095個基因差異表達(p＜0.01)，差異表達基因在7至9天(2873)和9至10天(2720)富集，這可能與玉米胚乳9天開始合成

4、淀粉等儲藏物質有關。差異表達基因的pathway分析結果顯示，差異基因主要參與糖和淀粉代謝，細胞壁形成，激素合成及信號轉導，氧化還原反應，轉錄調控等途徑。
　　(2)在淀粉合成關鍵酶基因啟動子序列中，24個順式作用元件顯著富集，結合轉錄因子與淀粉合成關鍵酶基因表達之間的相關分析，構建了轉錄調控網(wǎng)絡。通過生物信息學篩選到一個MYB家族轉錄因子MYB127可調控8個淀粉合成相關酶基因表達。采用酵母單雜交及胚乳中過表達MYB127蛋白提

5、高淀粉去分支酶(Isa1)基因啟動子活性的方法，證明MYB127可上調淀粉去分去酶Isa1基因表達。
　　(3) miRNA高通量測序共鑒定到23個已知miRNA保守家族的113個已知miRNA。定量PCR驗證結果顯示miRNA表達趨勢與miRNA高通量測序結果基本一致。結合生物信息預測和miRNA與靶基因表達量的相關性分析，共鑒定到70個已知miRNA的靶基因。通過GO和KEGG pathway注釋，這些靶基因主要參與植物信號轉

6、導、轉錄調節(jié)、過氧化物酶體等。
　　(4) miRNA差異表達分析顯示，屬于11個家族的28個miRNA在胚乳發(fā)育過程中差異表達（P＜0.01），包括miR528、miR393、miR167、miR172、miR1432、miR156、miR171、miR319、miR159、miR398、miR408。miRNA167通過靶基因生長素響應因子(ARF)調控糖和淀粉等代謝途徑。miR159和miR319通過靶基因MYB49調控赤霉

7、素信號途徑。
　　(5)通過高通量測序獲得22個新miRNA,屬于13個miRNA家族。莖環(huán)PCR驗證結果顯示，其中7個miRNA家族的轉錄因子能在胚乳中成功克隆。
　　(6)我們在胚乳中檢測到CG、CHG、CHH三種形式的甲基化水平分別為73％-81％、56％-68％、2％-3％;在授粉后13天的穗位葉中檢測到CG、CHG、CHH三種形式的甲基化水平分別為82.50％、74.42％、3.05％，遠高于水稻、擬南芥等植物的甲