血管活性腸肽對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者PBMC中NF-κB及TNF-α的影響.pdf

1、目的：慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是呼吸系統(tǒng)最常見的慢性炎癥性疾病之一。近年來隨著對(duì)COPD炎癥的研究日益深入，發(fā)現(xiàn)多種炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子參與了COPD的發(fā)生發(fā)展。抑制炎細(xì)胞活性已成為治療COPD的研究熱點(diǎn)之一。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factorrκB，NF-κB）是一種可誘導(dǎo)的炎癥轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)炎細(xì)胞的活性和炎癥因子的合成起很重要作用。抑制NF-κB

2、活化，可抑制炎細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，最終抑制炎癥反應(yīng)的瀑布效應(yīng)。
　　 脂多糖（lipopolysacachafide，LPS）是G-菌外膜的一種大分子物質(zhì)，可以激活炎癥細(xì)胞中炎癥轉(zhuǎn)錄因子的活性，誘導(dǎo)促炎因子的大量生成，放大炎癥反應(yīng)。
　　 血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide， VIP）是一種廣泛存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)肽，具有廣泛的生物學(xué)作用。VIP陽性神經(jīng)纖維廣泛分布于呼吸

3、道內(nèi)，VIP作為非腎上腺素能非膽堿能抑制性神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，參與呼吸道多種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，其中包括抑制炎細(xì)胞的活性。大量研究表明VIP能抑制炎細(xì)胞釋放多種炎性介質(zhì)，其部分機(jī)制是通過阻止核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化而實(shí)現(xiàn)的。而VIP是否對(duì)COPD同樣有抗炎作用如何目前還不清楚。
　　 本研究采用COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralblood mononuclear cell，PBMC）為研究對(duì)象，應(yīng)用VIP干預(yù)

4、LPS刺激前后的COPD患者PBMC，比較細(xì)胞中NF-κB和TNF-α的變化，從細(xì)胞水平上探討VIP對(duì)COPD的抗炎作用，為臨床應(yīng)用VIP或其模擬物治療COPD提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 選取正常人和COPD急性加重期（AECOPD）患者為研究對(duì)象，兩組在性別、年齡和吸煙指數(shù)均有可比性。無菌條件下，抽取兩組人群肘靜脈血5 ml，置于肝素抗凝（25 u/ml）管中，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液，分離出PBMC。
　　

5、 1.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達(dá).將PBMC用無血清1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2.0×106個(gè)/ml置入48孔培養(yǎng)板中，每孔0.5 ml。COPD組隨機(jī)分為4組：①空白對(duì)照組；②VIP組：VIP終濃度為10-8M；③LPS組：LPS終濃度為1 mg/L；④VIP+LPS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為10-8M的VIP，20分鐘后加入終濃度為1 mg/L的LPS。正常組僅用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。上述配好的液體分別培養(yǎng)1.5

6、小時(shí)后收集細(xì)胞，離心（800 rpm，10 min4℃），棄去上清，甩片干燥，冷丙酮固定，做免疫細(xì)胞化學(xué)。檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)。
　　 2.放射免疫方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的TNF-α的濃度：提取出的單個(gè)核細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2.0×106個(gè)/ml置入48孔培養(yǎng)板中，每孔0.5 ml。隨機(jī)分為4組：①空白對(duì)照組；②VIP組：VIP終濃度分別為0、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M

7、、10-6M。③LPS組：LPS終濃度為1 mg/L.④VIP+LPS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為10-8M的VIP，20分鐘后加入終濃度為1 mg/L的LPS。正常組僅用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組分別培養(yǎng)8小時(shí)后，4℃低溫水平離心機(jī)離心（2000 rpm，5 min），取細(xì)胞上清，-80℃保存，放射免疫法檢測(cè)TNF-α的含量。
　　 3.應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。正常組與COPD

8、的空白對(duì)照組比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，COPD各組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVY），如差異有顯著性進(jìn)一步用Student-Newman-Keuls（SNK-q）檢驗(yàn)，p<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明：①正常組NF-κBp65蛋白表達(dá)水平明顯低于AECOPD空白對(duì)照組（p<0.05）；②AECOPD各組中，四組細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較，有明顯差

9、異（p<0.01）。③LPS刺激PBMC后，細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（p<0.01）；④VIP組NF-κB p65蛋白表達(dá)低于空白對(duì)照組（p<0.05）；⑤VIP+LPS組NF-κBp65蛋白表達(dá)水平低于LPS組，（p<0.05）；⑥空白對(duì)照組與VIP+LPS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　 2.放射免疫法測(cè)定PBMC上清液中TNF-a含量變化：①正常組TNF-a含量明顯低于AECOP

10、D空白對(duì)照組（p<0.05）；②AECOPD各組中，四組細(xì)胞上清液中TNF-α的含量比較有明顯差異，（p<0.01）；③LPS刺激PBMC后，細(xì)胞上清液中TNF-α的含量明顯高于空白對(duì)照組（p<0.01）；④VIP組TNF-α的含量低于空白對(duì)照組（p<0.05）；VIP+LPS組TNF-α的含量低于LPS組（p<0.05）；⑥空白對(duì)照組與VIP+LPS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　 3.放射免疫法測(cè)定PBMC上

11、清液中TNF-α含量與VIP濃度的相關(guān)性：隨著VIP濃度升高，TNF-a含量逐漸降低。VIP在10-6M、10-7M、10-8M時(shí)、TNF-α的含量均明顯低于10-9M組、10-10M組和0M組（p<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.NF-κB和TNF-α參與了COPD的炎癥反應(yīng)。
　　 2.VIP可抑制AECOPD患者炎細(xì)胞內(nèi)炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化并抑制炎細(xì)胞釋放TNF-α，且對(duì)TNF-α的抑制作用具有