PMSF拮抗TOCP母雞中樞神經(jīng)組織中NFs變化及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 有機(jī)磷化合物(organophosphorus compounds,OPs)應(yīng)用廣泛,主要用作農(nóng)藥、增塑劑、阻燃劑、油料添加劑、潤(rùn)滑劑及神經(jīng)毒劑等。OPs除導(dǎo)致急性中毒外,還會(huì)引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)病(organophosphate-induced delayedneuropathy,OPIDN)。該病一般發(fā)生于急性中毒恢復(fù)后,潛伏期為2周左右,主要是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)中長(zhǎng)傳導(dǎo)束路和外周神經(jīng)系統(tǒng)的長(zhǎng)神經(jīng)中軸突退行性變?yōu)橹饕卣?/p>

2、,會(huì)導(dǎo)致感覺、運(yùn)動(dòng)的異常改變。臨床上尚無(wú)特效治療方法,主要是對(duì)癥支持治療,預(yù)后差。目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但從其超微結(jié)構(gòu)上能觀察到神經(jīng)絲(neurofilaments,NFs)、微管等在軸突聚集和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生等異常改變。本實(shí)驗(yàn)室前期研究了磷酸三鄰甲苯酯(tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)誘導(dǎo)OPIDN母雞神經(jīng)系統(tǒng)中NFs在21d的變化,但整個(gè)OPIDN發(fā)生發(fā)展過(guò)程中NFs如何變化尚無(wú)研究。鑒于以前研究表明

3、,對(duì)母雞一次性灌胃750mg/kg TOCP前24h注射60mg/kg苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)能起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn),通過(guò)建立TOCP誘導(dǎo)的母雞OPIDN模型和PMSF阻斷OPIDN模型觀察在0,1,5,10,21d不同時(shí)間點(diǎn)中樞神經(jīng)中NFs亞單位含量變化,研究NFs在OPIDN進(jìn)程中所起的作用。并在此基礎(chǔ)上,通過(guò)研究上述兩種模型中鈣激活的中性蛋白酶(Ca2+-act

4、ivated neutral protease,calpain)途徑和周期蛋白依賴性的蛋白激酶5(cyclin dependent kinase5,CDK5)介導(dǎo)NFs磷酸化和NFs降解的變化,揭示TOCP誘導(dǎo)NFs異常的因?yàn)?探討OPIDN的發(fā)病機(jī)制,為其治療和預(yù)防提供基礎(chǔ)資料。
　　 方法
　　 1.TOCP誘導(dǎo)母雞OPIDN動(dòng)物模型和PMSF阻斷OPIDN動(dòng)物模型的建立:成年羅曼母雞適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后,隨機(jī)分為TOC

5、P組和PMSF+TOCP組,每組分為0d(即正常對(duì)照組)、1d、5d、10d、21d5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(n=8),PMSF按0.1 ml/kg的劑量(即60mg/kg)一次性皮下注射PMSF+TOCP組的動(dòng)物,24h后,給予TOCP組和PMSF+TOCP組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次性經(jīng)口灌胃750mg/kg TOCP,正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水。密切觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒前后一般狀況的變化,測(cè)量體重,觀察其OPIDN癥狀并按8級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)(0,正常行走；

6、1～2,間或的雙腿運(yùn)動(dòng)輕微不協(xié)調(diào)；3～4,明顯的雙腿運(yùn)動(dòng)中度不協(xié)調(diào)；5～6,嚴(yán)重的、頻發(fā)的站立和行走困難；7～8,雙腿完全癱瘓)。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死各組動(dòng)物,迅速取出大腦和脊髓,置于液氮中,-80℃保存。
　　 2.中樞神經(jīng)組織中NFs3種亞單位含量的測(cè)定:取母雞大腦和脊髓組織加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(1％TritonⅩ-100,50mM Tris-HCl,(pH7.5),25mMKCl,2mM MgCl2,5mM EGTA,5mM

7、DTT,Protease Inhibitor Cocktail(0.5μl/mgprotein),磷酸酶抑制劑(5mM Na3VO4,10mM Na4P2O7和1mM碘乙酸))制備勻漿,100,000g、4℃離心60min,分離出上清和沉淀兩種組份。利用SDS-PAGE和Western-blotting技術(shù)分別測(cè)定神經(jīng)組織勻漿后上清和沉淀兩種組份中高分子量神經(jīng)絲(high molecular neurofilament,NF-H),中分

8、子量神經(jīng)絲(mediummolecular neurofilament,NF-M)和低分子量神經(jīng)絲(low molecular neurofilament,NF-L)3種NF蛋白的含量。
　　 3.中樞神經(jīng)組織中calpain活性測(cè)定:將大腦和脊髓組織分別剪碎后按質(zhì)量體積比1:10加入勻漿緩沖液(10mM NaHCO3,5mM NaN3,15mM Tris-HCl,pH6.8),2000轉(zhuǎn)/分,上下勻漿20次,10,919g、4

9、℃離心20min,取上清150μl,加入1ml的反應(yīng)緩沖液(145mM NaCl,100mM Tris-HCl,pH7.3),37℃水浴箱中孵育10min,再加入1500μl的5000μM的calpain substrate,在37℃水浴箱中振蕩60min后取出1ml加入比色皿,在熒光分光光度計(jì)上用波長(zhǎng)360nm的光線激發(fā)后,測(cè)定在440nm處發(fā)射的熒光強(qiáng)度。
　　 4.中樞神經(jīng)組織中CDK5含量的測(cè)定:取大腦和脊髓組織,按質(zhì)量

10、體積比1:4加入勻漿緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.4),150mM NaCl,1mM MgCl2,5mM EGTA,2mM EDTA,1mM PMSF,Protease Inhibitor Cocktail(0.5μl/mgprotein)),制備組織勻漿,14,000轉(zhuǎn)/分,4℃離心15min,取出上清,利用SDS-PAGE和Western-blotting技術(shù)測(cè)定大腦和脊髓中CDK5的含量變化。
　　 結(jié)果

11、r>　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀況變化
　　 TOCP組動(dòng)物染毒后未觀察到急性中毒癥狀,約從第5d開始出現(xiàn)肢體活動(dòng)減少,輕微的步態(tài)不平衡,之后步態(tài)失調(diào)逐漸加重,走路搖擺、跌跤,繼之行走困難,15天內(nèi)完全癱瘓,此狀態(tài)持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,體重呈下降趨勢(shì);PMSF+TOCP組動(dòng)物未見明顯OPIDN癥狀,體重變化不明顯。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中樞神經(jīng)組織中NFs含量變化
　　 2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腦中NFs含量變化
　　 T

12、OCP染毒后母雞大腦中NFs含量明顯改變,且在沉淀中比在上清中變化更明顯?？偟内厔?shì)是從第1d開始降低,第10d達(dá)到最低,第21d有所恢復(fù)。大腦沉淀中NF-L、NF-M和NF-H在第10d分別降低了86.2％(P<0.01),87.0％(P<0.01),54.1％(P<0.05)。提前24h給予PMSF后,與正常對(duì)照組相比較,大腦上清和沉淀中NF-L和NF-M均無(wú)明顯變化,NF-H有所增加,其在沉淀中第5d增加最多達(dá)89.4％(P<0.0

13、1)。沉淀中PMSF+TOCP組NF3個(gè)亞單位比TOCP組在各時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的增加。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓中NFs含量變化
　　 TOCP染毒后母雞脊髓組織上清和沉淀中NFs含量均明顯改變。與正常對(duì)照相比,沉淀中3種NF亞單位的含量表現(xiàn)為先降低后恢復(fù),均在10d時(shí)達(dá)到最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),這與大腦中變化相似。上清中3種NF亞單位的變化趨勢(shì)與沉淀基本一致,均在染毒后10d出現(xiàn)顯著降低,到21d時(shí)恢

14、復(fù)到正常水平。其中,10d時(shí)NF-L、NF-M和NF-H的含量降低幅度分別達(dá)到50.9％、86.4％和37.9％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提前24h給予PMSF再染毒TOCP的母雞在21天觀察時(shí)間內(nèi)脊髓中NFs紊亂明顯減輕。與正常對(duì)照相比,脊髓樣品勻漿離心后的沉淀中只有NF-M在第21d增加了35.1％(P<0.05),其余變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上清中只有NF-H和NF-M在21d增加了14.6％和28.9％(P<0.05),其余變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

15、義。
　　 3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中樞神經(jīng)中calpain活性
　　 與正常對(duì)照組相比,TOCP單獨(dú)染毒后母雞大腦中calpain活性在第1、5、10和21天分別增加26.4％(P<0.05)、29.0％(P<0.01)、38.5％(P<0.01)和23.0％(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；脊髓中calpain活性在各時(shí)間點(diǎn)分別增加11.2％、52.3％(P<0.01)、85.8％(P<0.01)和103.3％(P<0.01)

16、,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提前24h給予PMSF組,除10d外,脊髓中calpain活性基本恢復(fù)正常；與正常相比,大腦中其活性反而增加很明顯,第1、5、10和21天分別增加104.4％(P<0.01)、70.9％(P<0.01)、149.1％(P<0.01)和112.5％(P<0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1.經(jīng)口灌胃750mg/kg TOCP后母雞出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào),站立困難,最終癱瘓；提前24h注射60mg/kg PMSF再

17、給予750mg/kg TOCP的母雞未出現(xiàn)明顯OPIDN癥狀,研究證實(shí)了提前應(yīng)用PMSF能有效阻斷OPIDN的發(fā)生。
　　 2.TOCP染毒母雞大腦和脊髓組織中NFs含量都出現(xiàn)紊亂。提前給予PMSF在有效阻斷OPIDN的同時(shí),顯著抑制了中樞神經(jīng)組織中NFs的紊亂。結(jié)果提示TOCP誘發(fā)的NFs紊亂參與了OPIDN的發(fā)生。
　　 3.TOCP導(dǎo)致母雞大腦和脊髓中calpain過(guò)度激活,PMSF預(yù)處理僅能抑制脊髓中calpai