化學計量學輔助GC-MS用于辛夷揮發(fā)油化學成分和抗炎作用機制研究.pdf

1、針對中藥復雜體系定性定量分析與藥效機制研究方面面臨的瓶頸問題，本課題以辛夷揮發(fā)油為研究對象，應用氣相色譜-質譜聯(lián)用分析手段，結合化學計量學方法及代謝組學研究技術，對辛夷揮發(fā)油的組成、藥代動力學、藥效學、作用機制等進行了全面、系統(tǒng)的研究，為揭示辛夷揮發(fā)油藥效物質基礎提供了依據，對于含有辛夷的中藥復方的藥效學研究亦具有一定的借鑒意義。
　　 具體研究內容如下：
　　 1.氣相色譜中目標色譜峰保留時間的預測
　　 先是

2、基于恒溫及一階程序升溫條件下目標色譜峰的保留時間，對一階程序升溫條件下另一升溫速率的該目標色譜峰保留時間進行預測。結果表明，預測值和測量值的相對偏差較大；然后，在一階程序升溫條件下，用兩個不同升溫速率下目標色譜峰的保留時間來預測另一速率下的保留時間，預測值與實測值較為接近，只有個別組分相對偏差大于1％，其它相對偏差較小。比之在恒溫下對目標色譜峰保留時間的預測值來說，相對偏差明顯減小。
　　 基于實際需要，建立了可用于二階及多階程

3、序升溫的目標色譜峰保留時間預測的方法。先以標準對照品為研究對象，預測正十六酸和二十九烷在二階程序升溫條件下的保留時間。結果顯示，預測值與實測值的相對偏差小于0.2％。然后以辛夷揮發(fā)油成分為考察目標，相對偏差小于0.15％，預測結果滿意。并對一階和二階程序升溫條件下保留時間預測相對偏差進行了比較。結果顯示，二階條件下的預測值和真實值更為接近。該預測方法可用來優(yōu)化氣相色譜條件，節(jié)省分析時間，提高分析效率，在實際工作中具有較好的應用價值。

4、r>　　 2.化學計量學分辨技術和聯(lián)用色譜技術用于辛夷揮發(fā)油的復雜成分分析
　　 通過GC-MS聯(lián)用，結合直觀推導式演進特征投影法（HELP）對辛夷揮發(fā)油的成分進行了定性和定量分析。以重疊色譜峰簇A和B為例，在解析過程中，先后使用FSMWEFA，ELPG和HELP方法，對重疊色譜峰進行了解析。解析結果顯示：峰簇A是含有三組分的峰簇，峰簇A中的三個化合物分別為o-Cymene，D-Limonene和Eucalyptol，相對含量

5、分別為2.27％，4.52％，14.20％；峰簇B經FSMWEFA法解析是4組分體系，但2D-ELPG顯示為3組分體系，為進一步確定體系組分數，采用3D-ELPG方法進行確認后，峰簇B包括四個化合物，解析結果和NIST數據庫比對后，確認分別是Carotol，τ-Cadinol，τ-Muurolol和la-Cadin-4-en-10-ol，相對含量分別是0.13％，1.41％，1.01％，0.41％。采用此策略對辛夷揮發(fā)油進行解析后，化合

6、物由原來直接由NIST檢索的65個增加至80個。
　　 在本研究中，我們充分利用了3D-ELPG的信息，解析結果更為準確可靠?？梢钥闯?，GC-MS聯(lián)用結合HELP方法可成功的用于分析辛夷揮發(fā)油成分，也充分說明化學計量學在分析復雜體系中具有潛在的優(yōu)勢，可提高組分定性和定量的準確性。
　　 3.辛夷揮發(fā)油成分GC-MS指紋圖譜的建立
　　 通過多元曲線分辨一偏最小二乘法（MCR-ALS）對12批辛夷揮發(fā)油的重疊色譜峰

7、進行了批量解析，增加了定性定量的準確性；確定了12批樣品中辛夷揮發(fā)油的共有組分及含量，確定了辛夷揮發(fā)油中最主要的化合物，包括桉油精，異合金歡醇，α-水芹烯，莰烯，檸檬烯，α-杜松醇，α-芳樟醇，石竹烯，鄰聚傘花素等。采用n強峰、共有峰率及變異率對指紋圖譜進行了評價，建立的方法穩(wěn)定、可靠，較為全面的反映了辛夷揮發(fā)油的化學成分，為辛夷藥材質量標準奠定了基礎。
　　 4.辛夷揮發(fā)油中主要活性成分1，8-桉葉素的藥代動力學初步研究

8、>　　 以1，8-桉葉素為研究對象，采用液-液萃取法提取血漿樣品，建立了以α-蒎烯為內標的氣相色譜法檢測血漿樣品中1，8-桉葉素濃度的方法。色譜分離條件為毛細管柱：SPBTM-1，0.25 mm×30 m×0.25μm；FID檢測器；載氣：氮氣，流速1.0 mL/min；程序升溫條件：起始柱溫50℃，保持2 min，再以5℃/min的速率升溫至100℃，保持2 min。采用本文建立的生物樣品預處理方法和氣相色譜法測定樣品中1，8-桉葉

9、素的含量，生物樣品預處理方法回收率高，色譜分離選擇性好。本法的準確度、精密度、專屬性和定量線性范圍均達到體內藥物分析的要求。線性相關系數為0.999，日內精密度范圍是3.75～5.74％，日間精密度范圍是2.41～5.58％。
　　 用上述建立的氣相色譜法測定血漿中1，8-桉葉素的濃度，根據所得的血藥濃度-時間曲線，采用非房室模型推算藥物動力學參數。結果表明，SD大鼠口服1，8-桉葉素后體內血藥濃度消除較慢，個體差異較大。經非房

10、室模型法估算的SD大鼠口服給藥后達峰時間為2h，達峰濃度為36.223μg/ml，藥時曲線末端相消除半衰期為4.811h，平均滯留時間為7.923h，AUC0～12和AUC0～∞別為227.09μg·h/ml，280.06μg`h/ml。
　　 5.辛夷揮發(fā)油抗炎作用的代謝組學初步研究
　　 首先建立角叉菜膠致大鼠急性炎癥模型，然后從藥效學角度證明辛夷揮發(fā)油具有較好的抗炎活性。然后采用GC-Ms分析正常組、模型組及給藥組

11、的三種不同狀態(tài)下大鼠的血漿代謝譜，采用NIST數據庫對不同組別大鼠血漿中的內源性代謝物進行鑒定，使用多元模式識別方法分析大鼠不同組間的代謝物譜差異。在正常組和模型組的得分矩陣圖中，兩組的樣本點完全分離，說明致炎后大鼠正常生理代謝被干擾，從機體生理內源性代謝物變化的層面可以認為炎癥模型造模成功。在正常組、模型組及給藥組的得分矩陣圖中，三組的樣本點也達到了分離，而對照組和給藥組在第二主成分上毗鄰，這表明給藥組樣本有向對照組移動的趨勢。

12、>　　 從三組的載荷矩陣圖中，可以得到對分類貢獻較大的生物標記物。數據結果表明，模型組中尿素、戊二胺、甘氨酸及乳酸的含量升高，且尿素和尸胺對分類貢獻最大，可認為是角叉菜膠致炎對大鼠機體生理內源性代謝產生擾動的生物標記物。給藥組中尿素、戊二胺、甘氨酸及乳酸的含量下降，回到正常水平，而軟脂酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、膽固醇的含量升高，且高于正常組，可認為是給藥后的生物標記物。通過文獻調研表明，這些標記物的改變和其抗炎活性存在一定