1α，25二羥維生素D-,3-靶控ERα基因表達(dá)載體構(gòu)建及其聯(lián)合他莫西芬對ER陰性乳腺癌細(xì)胞抑制效應(yīng)的研究.pdf

1、盡管隨著醫(yī)療手段的不斷進(jìn)步，乳腺癌的死亡率在近十年來得以顯著下降，但其仍然是所有罹患癌癥女性的第二大致死因素，在目前針對雌激素受體陽性乳腺癌患者的治療手段中，以抑制乳腺癌細(xì)胞的雌激素反應(yīng)性為主要手段的內(nèi)分泌療法取得了很好的療效。這其中，以競爭性抑制雌激素受體轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性為目的的抗雌激素療法尤為引人注目。 作為核受體超家族的成員之一，雌激素受體(estrogenreceptor，ER)能夠與其配體—雌激素發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而形成受

2、體二聚體，并與細(xì)胞核內(nèi)的相關(guān)調(diào)控因子一起與相關(guān)靶基因上游的雌激素反應(yīng)元件(estrogenresponsiveelement，ERE)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體并對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，最終發(fā)揮雌激素的促進(jìn)細(xì)胞增殖等生物學(xué)效應(yīng)，在生理情況下，體內(nèi)雌激素及其受體的存在對于女性生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育及其生理功能的發(fā)揮具有不可替代的作用。但在乳腺癌細(xì)胞中，雌激素受體與雌激素的結(jié)合同樣能夠提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲性，并能促進(jìn)其發(fā)生轉(zhuǎn)移，是罹患乳腺癌

3、的重要危險(xiǎn)因素。鑒于雌激素的作用有賴于其特異性受體的存在，為了拮抗雌激素在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)，人們陸續(xù)發(fā)明了一系列能夠競爭性結(jié)合雌激素受體的藥物，即選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selectiveestrogenreceptormodulator，SERM)，這其中最具代表性的藥物首推他莫西芬(Tamoxifen，又名三苯氧胺)。當(dāng)他莫西芬與乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的雌激素受體發(fā)生結(jié)合后，可抑制雌激素受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，從而有阻遏制腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)

4、程、抑制其增殖活性，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。因此，自從上世紀(jì)70年代投入臨床使用以來，他莫西芬大大提高了雌激素受體陽性乳腺癌患者的5年生存率，目前，以他莫西芬為代表的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑已經(jīng)成為臨床上除了傳統(tǒng)的放、化療外治療雌激素受體陽性乳腺癌的首選藥物之一。然而，在乳腺癌患者尤其是絕經(jīng)期后的乳腺癌患者中，仍有相當(dāng)一部分患者由于其腫瘤細(xì)胞的雌激素受體表達(dá)缺失或突變而缺乏對以他莫西芬為代表的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑的敏感性。同時(shí)，相關(guān)的臨床研究

5、也顯示雌激素受體的缺失與乳腺癌患者的預(yù)后呈明顯的負(fù)相關(guān)聯(lián)系。 1α，25二羥維生素D3[1α，25(OH)2D3，以下簡稱活性維生素D3]是維生素D在體內(nèi)的活性形式，其傳統(tǒng)的生理功能主要是維持體內(nèi)鈣離子濃度的穩(wěn)定以及促進(jìn)骨骼的鈣化。然而，近年來隨著相關(guān)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)活性維生素D3對于包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤有著很強(qiáng)的抑制作用?；钚跃S生素D3在腫瘤細(xì)胞內(nèi)首先與其特異性的受體—活性維生素D3受體(VitaminD3rece

6、ptor，VDR)發(fā)生結(jié)合，發(fā)生受體—配體結(jié)合后的VDR隨即與視黃醇X受體(RetinoidsXreceptor，RXR)形成異源二聚體，繼而在細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)調(diào)控因子的參與下與活性維生素D3靶基因上游的活性維生素D3反應(yīng)元件(VitaminD3responsiveelement，VDRE)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物并對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，最終影響細(xì)胞的周期進(jìn)程和增殖活性，并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生分化或凋亡，受到活性維生素D3調(diào)控的腫瘤相關(guān)基因包括

7、BRCA1、p21、CyclinD1等。對于乳腺癌患者尤其是雌激素受體陰性的乳腺癌患者而言，由于活性維生素D3對腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)并不完全依賴于雌激素受體的存在，從而引起了人們的高度關(guān)注，大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其對于雌激素受體陰性和陽性的腫瘤均具有較強(qiáng)的抑制作用。然而，由于活性維生素D3在抑制腫瘤的同時(shí)還具有較強(qiáng)的升高血鈣的作用，長時(shí)間過量使用極易產(chǎn)生高鈣血癥等副作用，從而限制了活性維生素D3的臨床應(yīng)用。 有鑒于此，為了探討一種

8、全新的利用活性維生素D3和他莫西芬治療雌激素受體陰性乳腺癌的方法，本研究在體外構(gòu)建了一個(gè)受活性維生素D3調(diào)控的雌激素受體α真核表達(dá)質(zhì)粒。首先，通過構(gòu)建一個(gè)帶有4個(gè)拷貝的VDRE序列和Tk啟動(dòng)子片斷的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)報(bào)告基因載體證觀察活性維生素D3能否通過這個(gè)特異性啟動(dòng)子片斷有效誘導(dǎo)下游報(bào)告基因的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)構(gòu)建帶有相同VDRE-Tk啟動(dòng)子片斷的雌激素受體α真核表達(dá)質(zhì)粒，使雌激素受體α的表達(dá)受控于VDRE-Tk啟動(dòng)

9、子，并將其轉(zhuǎn)染到雌激素受體陰性的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中，同時(shí)，通過將該表達(dá)株移植到裸鼠體內(nèi)建立起相應(yīng)的裸鼠移植瘤模型，從而使得MDA-MB-231細(xì)胞能夠在活性維生素D3的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為雌激素受體陽性細(xì)胞，并利用MTT技術(shù)、流式細(xì)胞儀技術(shù)和TUNEL技術(shù)檢測了維生素D3聯(lián)合他莫西芬對MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期分布以及凋亡的影響，并利用免疫組化以及測量腫瘤體積的變化等方法觀察活性維生素D3聯(lián)合他莫西

10、芬對MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用。在此基礎(chǔ)上，利用免疫印記技術(shù)、免疫沉淀技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測經(jīng)活性維生素D3聯(lián)合他莫西芬處理后，MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞及其裸鼠移植瘤細(xì)胞中VDR、NFκB和CyclinD1、CDK4、pRb等細(xì)胞周期相關(guān)分子的表達(dá)及活性變化，并對活性維生素D3聯(lián)合他莫西芬對MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞及其裸鼠移植瘤抑制作用的相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行

11、探討。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下： 1.通過將綠色熒光蛋白載體IRES2-eGFP上游的CMV啟動(dòng)子替換為含有4個(gè)拷貝的VDRE序列和Tk啟動(dòng)子，從而構(gòu)建了pVDRE-Tk-eGFP報(bào)告基因載體，并將其轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細(xì)胞中。本研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D3可在體外有效誘導(dǎo)eGFP報(bào)告基因的表達(dá)，并呈明顯的時(shí)間、劑量和表達(dá)量依賴的關(guān)系，說明該依賴于活性維生素D3報(bào)告基因載體的構(gòu)建是成功的，并且證實(shí)了活性維生素D3可通過VDRE-

12、Tk啟動(dòng)子有效調(diào)控下游目的基因的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本研究又成功構(gòu)建了含有4個(gè)拷貝的VDRE的Tk啟動(dòng)子的雌激素受體α真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染到雌激素受體陰性的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，活性維生素D3可通過VDRE-Tk啟動(dòng)子有效誘導(dǎo)雌激素受體α的表達(dá)從而使雌激素受體陰性的MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)化為雌激素受體陽性細(xì)胞，并呈明顯的時(shí)間和劑量依賴的關(guān)系。 2.MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的MDA

13、-MB-231乳腺癌細(xì)胞相比，一定劑量的活性維生素D3和他莫西芬能夠有效協(xié)同抑制MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞的增殖活性，并能將細(xì)胞周期進(jìn)程阻遏于G0/G1期。同時(shí)，TUNEL檢測結(jié)果顯示，活性維生素D3和他莫西芬還能夠協(xié)同誘導(dǎo)MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對于轉(zhuǎn)染空載體的MDA-MB-231細(xì)胞，二者無法產(chǎn)生上述效應(yīng)，說明活性維生素D3可在體外通過調(diào)控雌激素受體α的表達(dá)使MDA-MB-231VDRE-E

14、Rα細(xì)胞重新獲得對他莫西芬的敏感性。 3.本研究將MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的MDA-MB-231細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，成功構(gòu)建了相應(yīng)的裸鼠移植瘤模型。經(jīng)一定劑量的活性維生素D3和他莫西芬單獨(dú)或聯(lián)合用藥后，與對照組相比，聯(lián)合處理組MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞移植瘤的體積和重量明顯降低。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合處理組移植瘤細(xì)胞Ki-67蛋白表達(dá)較對照組顯著降低，提示活性維生素D3和他莫西芬還能

15、夠在體內(nèi)協(xié)同抑制MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞的增殖能力，而對于轉(zhuǎn)染空載體的MDA-MB-231細(xì)胞移裸鼠移植瘤則無此效應(yīng)。 4.經(jīng)活性維生素D3和他莫西芬聯(lián)合處理后，MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞的VDR表達(dá)較對照組明顯升高，而CyclinD1的表達(dá)則顯著減弱，同時(shí)，CDK4的表達(dá)也有所降低，CyclinD1和CDK4的結(jié)合力也顯著降低。同時(shí)，pRb的表達(dá)也有所增強(qiáng)，但其磷酸化水平顯著降低，提示，活性維生素

16、D3和他莫西芬可通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)分子的表達(dá)和活性抑制MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞及其裸鼠移植瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。 5.經(jīng)活性維生素D3和他莫西芬聯(lián)合對MDA-MB-231VDRE-ERα細(xì)胞及其裸鼠移植瘤處理后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，聯(lián)合處理組細(xì)胞核內(nèi)NFκBp65亞單位含量顯著降低，同時(shí)其表達(dá)量也有所下降，提示活性維生素D3和他莫西芬聯(lián)合可通過抑制NFκBp65亞單位的核轉(zhuǎn)位來抑制其發(fā)揮促細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞

17、凋亡的功能。 綜上所述，本研究通過構(gòu)建帶有VDRE-Tk啟動(dòng)子的雌激素受體α表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染到雌激素受體陰性的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中能夠讓活性維生素D3通過VDRE-Tk這一有效的“基因開關(guān)”(geneswitch)誘導(dǎo)下游雌激素受體α的表達(dá)，從而使MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞從雌激素受體陰性表型轉(zhuǎn)化為雌激素受體陽性表型，最終有效恢復(fù)其對他莫西芬的化療敏感性，首次證實(shí)聯(lián)合運(yùn)用內(nèi)分泌治療藥物和基因重組技術(shù)可有效發(fā)揮他