YB-1蛋白調(diào)節(jié)K562細(xì)胞中mdr1基因誘導(dǎo)性表達(dá)的研究.pdf

1、目的：1.用化療藥物阿霉素(doxombicin,DOX)作用于白血病細(xì)胞K562，誘導(dǎo)多藥耐藥基因mdrl表達(dá)，檢測Y-盒結(jié)合蛋白1(YB-1)基因和蛋白表達(dá)情況及其核易位情況。初步探討YB-1蛋白與mdrl基因誘導(dǎo)性表達(dá)的關(guān)系。2.運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，使K562細(xì)胞中YB-1基因表達(dá)沉默，檢測YB-1基因沉默前后K562細(xì)胞中mdrl基因誘導(dǎo)性表達(dá)的差異。3.研究阿霉素誘導(dǎo)K562細(xì)胞mdrl基因表達(dá)過程中，MAPK/ERK信號通路

2、對于YB-1核易位，調(diào)節(jié)mdrl基因表達(dá)的作用。 方法：1.劑量逐漸遞增的阿霉素長期作用于K562細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測YB-1、mdrl基因表達(dá)改變情況，流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測各組細(xì)胞mdrl基因編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達(dá)水平，Weste

3、rn blotting法檢測誘導(dǎo)mdrl基因表達(dá)過程中YB-1蛋白表達(dá)及其核易位的變化情況。2.采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將分別攜帶有三種人YB-1基因特異性shRNA及隨機(jī)片段HK的真核表達(dá)載體(pGenesil-1/YBX11、pGenesil-1/YBX12、pGenesil-1/YBX13、pGenesil-1/HK)轉(zhuǎn)染進(jìn)K562細(xì)胞中，G418抗性篩選兩周后獲得陽性克隆。RT-PCR和Western blotting法分別檢測這四

4、組細(xì)胞和K562細(xì)胞中YB-1 mRNA和蛋白表達(dá)量的差異。取YB-1基因干擾效果最好的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以轉(zhuǎn)染隨機(jī)片段HK的細(xì)胞株(K562/HK)為對照組。RT-PCR及FCM分別檢測YB-1基因干擾前后阿霉素誘導(dǎo)K562細(xì)胞mdrl基因和P-gp表達(dá)的差異。3.運(yùn)用MAPK抑制劑PD98059預(yù)處理K562細(xì)胞一小時(shí)后，加入阿霉素共同作用(誘導(dǎo)方法同1)。RT-PCR檢測mdrl，YB-1基因表達(dá)的情況，F(xiàn)CM檢測P-gp的表達(dá)

5、情況，Western blotting法檢測ERK蛋白及其磷酸化情況，YB-1蛋白表達(dá)及其核易位的變化。 結(jié)果：1.隨著阿霉素作用濃度的增加，時(shí)間的延長，K562細(xì)胞mdrl基因表達(dá)逐漸上調(diào)，0.03μg/mL阿霉素作用24h就可以誘導(dǎo)mdrl及其編碼的P-gp的表達(dá)，同時(shí)YB-1基因和蛋白表達(dá)均增加，并且出現(xiàn)明顯的核易位。相關(guān)性分析顯示YB-1核易位與mdrl基因的轉(zhuǎn)錄，P-gp的表達(dá)呈正相關(guān)。2.通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將YB-

6、1 shRNA和HK重組載體轉(zhuǎn)染進(jìn)K562細(xì)胞，G418篩選2周獲得陽性克隆，依次為K562/HK、K562/Y1、K562/Y2、K562/Y3。流式細(xì)胞儀檢測顯示，重組質(zhì)粒均獲得較高轉(zhuǎn)染率，四組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率依次為(73.48±1.19)％、(52.46±1.23)％、(62.67±1.16)％、(57.25±1.31)％；RT-PCR結(jié)果顯示，K562/Y1和K562/Y3兩組細(xì)胞YB-1基因表達(dá)量明顯降低，K562/Y2略有減少。K

7、562、K562/HK、K562/Y1、 K562/Y2和K562/Y3五組細(xì)胞以β-actin標(biāo)化后的YB-1灰度值分別為0.2613±0.026、0.2395±0.011、0.1523±0.016、0.2233±0.021和0.0866±0.015。YBX11、YBX12和YBX13對YB-1 mRNA的抑制率分別為(41.0+0.01)％、(13.3±0.12)％和(65.7±0.09)％；Western blotting結(jié)果也顯

8、示，K562/Y1和K562/Y3兩組細(xì)胞YB-1的蛋白條帶強(qiáng)度比對照組細(xì)胞明顯減弱，說明YB-1shRNA的導(dǎo)入有效地抑制了目的基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白的表達(dá)。以抑制效果最好的K562/Y3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，K562/HK為對照排除轉(zhuǎn)染的影響。RT-PCR檢測顯示K562/Y3組阿霉素誘導(dǎo)的mdrl基因表達(dá)明顯弱于K562和K562/HK組，降低60％左右，F(xiàn)CM檢測P-gp的表達(dá)也獲得相似結(jié)果。提示YB-1蛋白參與了K562細(xì)胞mdrl基因的誘

9、導(dǎo)性表達(dá)。3.Western blotting檢測顯示阿霉素作用于K562細(xì)胞后ERK磷酸化增強(qiáng)，MAPK/ERK信號通路被激活。用MAPK抑制劑PD98059預(yù)處理K562細(xì)胞后能有效抑制阿霉素誘導(dǎo)ERK磷酸化，同時(shí)阿霉素所誘導(dǎo)的YB-1蛋白核易位也被明顯抑制，但對YB-1基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)沒有影響。RT-PCR檢測顯示PD98059作用后阿霉素誘導(dǎo)的mdrl基因轉(zhuǎn)錄下降70％左右，F(xiàn)CM檢測顯示P-gp的表達(dá)也明顯減少。因此MAPK/E

10、RK信號通路參與了阿霉素所誘導(dǎo)的YB-1核易位和mdrl基因的表達(dá)。 結(jié)論：阿霉素可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞YB-1蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)其核易位，從而調(diào)控mdrl基因的表達(dá)，YB-1基因沉默后mdrl誘導(dǎo)性表達(dá)減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK信號通路對阿霉素誘導(dǎo)YB-1蛋白核易位和mdrl基因表達(dá)起一定的作用，抑制ERK活化能有效阻斷YB-1蛋白核易位，下調(diào)mdrl基因的誘導(dǎo)性表達(dá)。我們的研究揭示了阿霉素誘導(dǎo)mdrl基因表達(dá)的機(jī)制，