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文檔簡介
1、由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)引起的菌核病是油菜的主要病害之一。利用抗病品種是該病害防治的經(jīng)濟(jì)有效措施。然而目前高抗材料缺乏,抗病分子機(jī)制尚不清楚,需要發(fā)展或采用新技術(shù)尋找關(guān)鍵的抗病基因,進(jìn)行抗病育種。近年來植物功能基因組學(xué)和基因工程的研究進(jìn)展迅速,特別是在模式植物擬南芥(Atabidopsis thaliana)中抗病性功能基因與抗病分子機(jī)制研究取得了突破性進(jìn)展。在油菜中嫁接和發(fā)
2、展這些技術(shù),克隆和研究油菜抗病性功能基因,以提高油菜對菌核病的抗性具有重要的理論和實(shí)踐意義。 本研究分為兩個部分。首先探討了化學(xué)信號分子對油菜的誘導(dǎo)抗病性,了解油菜中是否存在擬南芥的病害防御反應(yīng)機(jī)制。以此研究為依據(jù),選擇克隆油菜抗病相關(guān)基因,進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)研究,以明確這些基因的功能與抗病育種利用價值。 在誘導(dǎo)抗性研究中,所利用的化學(xué)物質(zhì)有病害防御反應(yīng)信號傳導(dǎo)分子甲基茉莉酸(MeJA)和苯丙噻重氮(BTH,水楊酸類似物),
3、以及菌核病毒素草酸(OA)。誘導(dǎo)處理油菜葉片后檢測病害防御反應(yīng)信號傳導(dǎo)途徑中標(biāo)記基因的時序表達(dá)情況,基因包括PDF1.2(茉莉酸途徑中的標(biāo)記基因)、PR-1(水楊酸途徑中的標(biāo)記基因)、NPR1(上述途徑調(diào)控基因)、APX(與氧爆發(fā)途徑相關(guān)的基因)以及PR-5、CLU和CHI等幾個病程相關(guān)蛋白基因。研究表明,化學(xué)處理能誘導(dǎo)這些基因不同程度的上調(diào)表達(dá)。由此推導(dǎo)油菜抗病反應(yīng)中可能存在這三種重要的病害防御反應(yīng)信號傳導(dǎo)途徑。 在轉(zhuǎn)基因功能
4、研究中,首先對由上述化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)的基因,即本課題組測序獲得的UniGene庫,進(jìn)行生物信息學(xué)分析,選擇出可能在主要抗病信號途徑中起作用的基因,然后分別構(gòu)建過表達(dá)和RNAi載體,進(jìn)行油菜轉(zhuǎn)化。生物信息學(xué)分析后選擇出三個全長基因,分別命名為BNT19K4、BNF7A10、BNF5011。以中間載體pG4A為基礎(chǔ),構(gòu)建了三個植物過表達(dá)載體pGTK、pGFA和pGF0,以pG4A-intron為基礎(chǔ)構(gòu)建了兩個RNAi植物表達(dá)載體pGRTK和
5、pGRF0。這些載體均包含抗除草劑草胺膦基因bar。采用類似花粉管通道法分別對甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。在甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化中,共獲得13002粒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的種子和17401粒RNAi轉(zhuǎn)化的種子。對轉(zhuǎn)基因T0代植株進(jìn)行除草劑篩選,獲得過表達(dá)植株305株(RNAi的種子尚未來得及篩選)。經(jīng)PCR鑒定,其中80%的植株為陽性。在植物過表達(dá)載體pGTK、pGF0和RNAi植物表達(dá)載體pGRTK、pGRFO轉(zhuǎn)化白菜型油菜中,抗除草劑的
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