結(jié)核不同感染狀態(tài)下宿主對結(jié)核特異性抗原獲得性免疫應(yīng)答的差異及相關(guān)分子標(biāo)識篩選.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌所致的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。近年來，結(jié)核病疫情越來越嚴(yán)重，其感染后引起患者的死亡率位居我國傳染病的首位。目前全球約有1/3的人口感染結(jié)核桿菌，每年新發(fā)的活動性結(jié)核病人有900多萬人，并且每年有近200萬人死于結(jié)核病。大多數(shù)人感染結(jié)核菌后并無臨床癥狀，稱為潛伏感染。但是有10％的潛伏感染者將在其一生的某個階段發(fā)展為活動性結(jié)核。潛伏感染不斷轉(zhuǎn)化為活動性結(jié)核，是造成結(jié)核病發(fā)病率居高不下的重要原因。因此，潛伏感染

2、者為結(jié)核病的控制和診斷帶來了巨大的挑戰(zhàn)。然而，對于機(jī)體如何控制潛伏感染，以避免發(fā)展為活動性結(jié)核的關(guān)鍵免疫機(jī)制仍知之甚少，同時臨床亦缺乏鑒別潛伏感染與活動性感染的生物靶標(biāo)。因此，全面的研究活動性結(jié)核與潛伏感染的免疫應(yīng)答差異對進(jìn)一步揭開抗結(jié)核免疫的機(jī)制和發(fā)展新的結(jié)核診斷方法具有重要意義，也為提出新型的結(jié)核病控制策略奠定基礎(chǔ)。
　　本研究首先用人全基因組表達(dá)譜芯片的方法，尋找結(jié)核不同感染狀態(tài)者的獲得性免疫在應(yīng)答PPD刺激時的差異。我們?nèi)?/p>

3、選了4名活動性結(jié)核患者(TB)，4名潛伏感染者(LTBI)及4名未感染結(jié)核菌的健康對照者(HC)。采其外周血分離外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)，用結(jié)核特異性抗原PPD刺激培養(yǎng)4小時，設(shè)置未刺激的PBMCs作為自身對照，消除本底差異。用雙熒光標(biāo)記雜交的方法，將來自于同一人的兩份RNA在同一張芯片上進(jìn)行雜交。對芯片結(jié)果的統(tǒng)計分析顯示，TB組和LTBI組的PBMCs對PPD刺激的應(yīng)答差異最為明顯，我們從中篩選到了286個差異表達(dá)基因;TB組與

4、HC組的差異基因數(shù)目與上述兩組相當(dāng)，差異表達(dá)基因為239個;LTBI組與HC組的差異最小，差異表達(dá)基因為94個。最終，我們通過維恩分析得到了506個在三組組間比較中差異表達(dá)的基因群。隨后用生物信息學(xué)的方法，我們又對差異表達(dá)的基因的功能進(jìn)行了分析。GeneOntology(GO)分析發(fā)現(xiàn)，胞外組分及應(yīng)對外來刺激的基因簇在LTBI組與HC組的差異表達(dá)基因中被顯著富集;與應(yīng)對外來刺激相關(guān)的基因簇也在TB組與LTBI組間存在差異;TB組與HC組

5、的差異基因簇最多，主要集中在受體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞外組分、應(yīng)對刺激、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和細(xì)胞通信等幾個方面。
　　隨后，我們又對結(jié)核感染者及活動性結(jié)核患者的PBMCs在PPD刺激時的特有免疫應(yīng)答進(jìn)行研究。我們比較了(1)結(jié)核感染者(TB組和LTBI組)與健康對照者（HC組）的PBMCs在應(yīng)答PPD刺激的差異;(2)活動性結(jié)核患者(TB組)與無臨床癥狀者（LTBI組和HC組）的PBMCs在應(yīng)答PPD刺激的差異。最終我們分別得到了由55個基

6、因所組成的結(jié)核感染者的特有的基因表達(dá)譜，及由229個基因所組成的活動性結(jié)核特有的基因表達(dá)譜。GO分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)核感染表達(dá)譜的差異基因在受體結(jié)合、應(yīng)對胞外刺激和細(xì)胞增殖調(diào)控幾個方面被顯著富集;活動性結(jié)核基因表達(dá)譜中的229個基因在受體結(jié)合、胞外成分、應(yīng)對胞外刺激、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、慢性炎癥調(diào)控和細(xì)胞增殖調(diào)控幾個方面被顯著富集。
　　為了驗證表達(dá)譜芯片的結(jié)果，我們進(jìn)行了實時定量PCR(qPCR)驗證實驗。為此，我們另外招募了83名參

7、與者，其中TB組為25名，LTBI組為36名，HC組為22名。結(jié)果顯示，81％的qPCR結(jié)果與芯片試驗結(jié)果一致，證明了芯片實驗數(shù)據(jù)可靠。同時，我們在該擴(kuò)大樣本的驗證中，也得到了一系列在相應(yīng)組間比較中存在差異表達(dá)的基因。
　　基于上述芯片實驗篩選及后續(xù)qPCR擴(kuò)大樣本驗證中得到的差異表達(dá)基因的mRNA表達(dá)水平，我們篩選到了新的活動性結(jié)核患者及結(jié)核感染者的分子標(biāo)識。ROC及決策樹分析發(fā)現(xiàn)，CXCL10，ATP10A和TLR6三個基因表

8、達(dá)水平的聯(lián)合對于區(qū)分TB組和LTBI組的敏感性為80％，特異性為89％。在區(qū)分TB組與無結(jié)核臨床癥狀組（LTBI&HC組）方面，我們發(fā)現(xiàn)CXCL10，ATP10A，TLR6，RAB20和IL2幾個基因表達(dá)水平的不同的聯(lián)合可以對二者進(jìn)行較好的區(qū)分。CXCL10，RAB20和IL2三個基因表達(dá)水平的聯(lián)合對于區(qū)分TB組和LTBI&HC組的陽性預(yù)測值最高，為90％，敏感性和特異性分別為72％和97％;另外，CXCL10，RAB20和ATP10A

9、區(qū)分這兩組的敏感性和特異性為84％和91％;CXCL10，TLR6和ATP10A三個基因聯(lián)合對于區(qū)分TB組和LTBI&HC組的敏感性和特異性為68％和97％。在區(qū)分結(jié)核感染者(TB<BI組)與HC組方面，IFN-γ，CXCL10，CXCL9及IL2RA四個基因聯(lián)合的效果良好，敏感性為98％，特異性為59％。
　　綜上所述，通過本研究篩選出的CXCL10，ATP10A，TLR6，RAB20，IL2，IFN-γ，CXCL9及IL2