不同感染狀態(tài)結(jié)核病牛免疫應(yīng)答差異分析及分子標(biāo)識篩選.pdf

1、不同感染狀態(tài)的結(jié)核病牛對牛群健康的影響不同，結(jié)核潛伏感染患牛(LTBI)通常是指患牛體內(nèi)存在牛分枝桿菌，結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)呈陽性，但無臨床癥狀，也不排菌。在某些情況下，患?？梢砸簧掷m(xù)感染而不發(fā)病。而活動性結(jié)核患牛，又稱開放性結(jié)核患牛，是指具有明顯臨診癥狀的結(jié)核菌素陽性牛，這種病?？蓮谋欠置谖?、乳汁和糞便不斷排出病原菌，因而對周圍的健康牛群和人類造成具大威脅，應(yīng)立即撲殺。目前，牛結(jié)核病主要的臨床檢測方法有結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、IFN-

2、γ釋放試驗(yàn)和血清學(xué)檢測等。但這些方法無法確定結(jié)核病牛所處的感染狀態(tài)，為了彌補(bǔ)這一缺陷，本研究擬通過對不同感染狀態(tài)的結(jié)核病牛進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片分析，從而篩選出差異基因，并進(jìn)行驗(yàn)證，以探究其作為檢測不同感染狀態(tài)結(jié)核病牛的分子標(biāo)識的潛力。具體開展了以下研究工作:
　　為了對不同感染狀態(tài)的結(jié)核病牛進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片分析，本研究通過結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、IFN-γ釋放試驗(yàn)和鼻拭子巢式PCR檢測，篩選了3個(gè)牛場共368頭奶牛，最終選定了5頭牛

3、為開放性結(jié)核患牛，6頭牛為潛伏感染結(jié)核患牛，5頭健康牛。將以上牛分別設(shè)置為開放性結(jié)核組、潛伏感染結(jié)核組和健康組，采集外周抗凝血，分離外周血淋巴細(xì)胞，采用PPD-B進(jìn)行刺激，6-8 h后收取細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，采用Bovine（牛）Affymetrix3IVT基因表達(dá)芯片進(jìn)行表達(dá)譜檢測。
　　通過對各組表達(dá)譜差異分析，篩選出7個(gè)可能有作為分子標(biāo)識的差異基因，基因標(biāo)志分別為:BOLA、LOC508666、BOLA-DQB、DDX3Y

4、、UTY、LOC781494、LOC786808。根據(jù)其基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，并對6個(gè)樣品進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)通過結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、IFN-γ釋放試驗(yàn)和鼻拭子巢式PCR檢測對其所處的感染狀態(tài)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示有C-Cmotif chemokine23、majorhistocompatibility complex, classⅡ, DQ beta和non-classical MHC classⅠ antigen這3個(gè)基因在開