四逆湯及銀杏葉制劑防治阿霉素性心力衰竭的作用及線粒體機(jī)制研究.pdf

1、心力衰竭幾乎是所有心血管疾病終末期的共同結(jié)局。盡管不斷有新的治療方法出現(xiàn)，雖然可以降低部分心血管疾病(特別是急性心肌梗塞)的死亡率，但是慢性心力衰竭的發(fā)病率和死亡率卻一直難以得到有效地控制。目前心衰的防治方法很多，但均不能令人滿意地阻止心力衰竭的發(fā)展或逆轉(zhuǎn)其病理改變，因此，深入探討其發(fā)病機(jī)制，以求找到更恰當(dāng)更有效的預(yù)防和治療策略，是當(dāng)前心力衰竭研究的重點(diǎn)之一。近年來(lái)隨著細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激與心力衰竭關(guān)系的提出，線粒體在氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋

2、亡通路中的作用，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，成為研究心力衰竭防治新的增長(zhǎng)點(diǎn)。 中醫(yī)中藥有著數(shù)千年的歷史，對(duì)于復(fù)雜疾病的成因和發(fā)展可以進(jìn)行多靶點(diǎn)全方位的調(diào)節(jié)。中藥治療心衰已經(jīng)逐漸成為防治心衰的一條重要途徑。四逆湯是醫(yī)圣張仲景《傷寒論》中所創(chuàng)經(jīng)典名方，該方以回陽(yáng)救逆的功效而著名。多年來(lái)，本課題組對(duì)四逆湯抗心肌缺血的作用做了系統(tǒng)研究，四逆湯可增強(qiáng)心肌收縮力，擴(kuò)張冠脈，改善心肌供血；清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抗氧化應(yīng)激作用；增加心肌AT

3、P含量；提高Bcl-2基因的表達(dá)，降低p53基因的表達(dá)。銀杏葉又名白果葉，為銀杏科植物銀杏(GinkgoBiloba)的干燥葉。其所含主要成分銀杏黃酮甙具有有效清除體內(nèi)有毒過(guò)氧自由基的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，銀杏葉具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，改善心肌缺血區(qū)的血液循環(huán)，減低心肌耗氧量；提高小鼠心臟和腦對(duì)缺氧的耐受力；降低缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞p53蛋白的表達(dá)，恢復(fù)bcl-2蛋白的表達(dá)等作用。因此，四逆湯和銀杏葉有可能從抗心肌組織及其線粒體氧化損傷的角度，來(lái)改善

4、心肌能量代謝，降低氧化應(yīng)激，減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而多環(huán)節(jié)地起到改善心功能，防治心衰發(fā)生發(fā)展的作用。本實(shí)驗(yàn)即觀察中藥方劑四逆湯與經(jīng)典的抗氧化藥物銀杏葉提取物防治阿霉素性心力衰竭的作用及其線粒體機(jī)制，并將四逆湯與銀杏葉提取物的作用進(jìn)行對(duì)比研究，為心力衰竭的中藥治療及阿霉素性心肌毒性的心肌保護(hù)藥物的開(kāi)發(fā)提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 一、四逆湯及銀杏葉制劑防治阿霉素性心力衰竭的作用研究 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、四逆

5、湯組和銀杏葉提取物組。對(duì)照組大鼠尾靜脈注射與模型組及用藥組注射的鹽酸阿霉素(3mg/kg)等體積的生理鹽水，1次/5天，共注射3次，第三次注射后第二天開(kāi)始，對(duì)照組和模型組雙蒸水灌胃。四逆湯組以四逆湯煎劑灌胃，3.75g生藥/kg體重。銀杏葉組以銀杏葉提取物溶液灌胃，100mg/kg體重。 1.四逆湯及銀杏葉提取物對(duì)阿霉素性心衰大鼠心功能的影響 臟器系數(shù)：模型組大鼠的肝臟和脾臟臟器系數(shù)顯著升高，而以四逆湯和銀杏葉提取物灌胃

6、后，大鼠的肝臟和脾臟臟器系數(shù)明顯下降(p＜0.01)，心臟的臟器系數(shù)在各組間比較，均未見(jiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。 病理學(xué)觀察：四逆湯和銀杏葉組可以明顯改善模型組大鼠心肌組織的紊亂排列及肌纖維的斷裂，改善肝脾組織的淤血，保證了組織的正常結(jié)構(gòu)。 心導(dǎo)管檢測(cè)結(jié)果顯示：模型組大鼠左心室舒張末期的壓力(LVEDP)顯著增高(p＜0.01)，說(shuō)明左室收縮功能減弱，應(yīng)用四逆湯和銀杏葉提取物后，LVEDP得到明顯改善(p＜0.

7、05)。模型組大鼠的±dp/dtmax均較對(duì)照組顯著降低(p＜0.01)，結(jié)合LVEDP的升高，說(shuō)明模型組大鼠發(fā)生了心力衰竭，心肌的收縮性和舒張性能均出現(xiàn)異常。四逆湯和銀杏葉提取物的應(yīng)用則可顯著改善心肌的舒縮性能(p＜0.01)，提高心衰大鼠的心功能。 2.四逆湯及銀杏葉提取物對(duì)心力衰竭大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 血液SOD活性及MDA含量：注射阿霉素后l天，各組大鼠血液SOD活性與對(duì)照組相比有所下降，MDA含量有所升高

8、，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，心衰組大鼠血液SOD活性明顯下降，MDA含量逐漸增多，注射后l周、2周和3周與對(duì)照組相比均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，經(jīng)過(guò)四逆湯和銀杏葉提取物治療后，可以有效地防止阿霉素造成的血液SOD活性下降及MDA生成的增多(p＜0.05)。 心肌組織的SOD活性和MDA含量檢測(cè)結(jié)果：模型組SOD活性顯著減低，MDA含量顯著增多(p＜0.01)，說(shuō)明心衰大鼠心肌抗氧化能力下降，心肌發(fā)生明顯的膜脂

9、質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；而四逆湯和銀杏葉提取物可以顯著提高心肌組織SOD活性降低MDA含量(p＜0.01)，有效保護(hù)了機(jī)體自身的抗氧化酶活性，提高機(jī)體對(duì)氧化損傷的防御能力，同時(shí)減輕細(xì)胞的氧化損傷及膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。 3.阿霉素性心力衰竭與心肌組織氧化應(yīng)激的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析表明，隨著心衰大鼠心肌LVEDP的增加，心肌組織SOD活性下降，而MDA含量則逐漸增加，表明LVEDP與心肌細(xì)胞的SOD活性呈負(fù)相關(guān)(p＜0.05)，與心肌

10、細(xì)胞的MDA含量呈正相關(guān)(p＜0.05)。 結(jié)果提示，阿霉素的應(yīng)用可導(dǎo)致大鼠心功能下降，用藥3周后會(huì)出現(xiàn)心力衰竭的表現(xiàn)，同時(shí)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。并且阿霉素所致的心功能的下降與氧化應(yīng)激作用密切相關(guān)，隨著氧化應(yīng)激的加重，心功能損傷也越嚴(yán)重，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。而四逆湯和銀杏葉提取物的應(yīng)用，可以明顯改善阿霉素造成的心功能降低，二者之間未見(jiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示，四逆湯和銀杏葉提取物均可能是通過(guò)保護(hù)心肌組織的正常結(jié)構(gòu)，減輕肝脾淤血

11、腫脹程度，降低阿霉素所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高機(jī)體的抗氧化能力，從而保護(hù)了心肌細(xì)胞，提高了大鼠的心功能。 二、四逆湯及銀杏葉制劑防治阿霉素性心衰心肌線粒體損傷的作用研究 三、四逆湯及銀杏葉制劑防治阿霉素性心衰心肌細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制研究 結(jié)果提示，阿霉素造成的心力衰竭的機(jī)制可能是由于氧自由基產(chǎn)生的增多，導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化損傷，出現(xiàn)氧化應(yīng)激，激活Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bid，使其

12、由胞漿中轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，抑制Bcl-2及Bcl-xl的抗凋亡作用，并參與促成線粒體膜的損傷，線粒體通透性增加，PT孔開(kāi)放，細(xì)胞色素C和AIF等蛋白由線粒體內(nèi)膜釋放到細(xì)胞漿中，進(jìn)而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞色素C可激活Caspase-9，并激活下游的Caspase-3，切割特異性底物，如維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的必需結(jié)構(gòu)蛋白、代謝和修復(fù)蛋白等，激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，造成DNA的裂解破壞形成DNA片段，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而AIF則可能直接作用于細(xì)胞核

13、，通過(guò)非Caspase依賴的途徑，也起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。相關(guān)性分析表明，心力衰竭組中，隨著氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，Bid蛋白的表達(dá)也增多；而隨著B(niǎo)id蛋白表達(dá)的增多，線粒體釋放細(xì)胞色素C增加，并且細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)升高。在本實(shí)驗(yàn)的條件下，我們也比較了四逆湯和銀杏葉提取物的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者具有相似的抗阿霉素性心力衰竭的作用，其機(jī)制均與線粒體途徑導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，四逆湯和銀杏葉提取物則可能在這個(gè)氧化應(yīng)激-線粒體損傷-細(xì)胞凋亡的途徑

14、上，作用于相應(yīng)的細(xì)胞因子靶點(diǎn)，提高心肌細(xì)胞和線粒體的抗氧化能力，減低膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制促凋亡蛋白Bid的活性，提高抗凋亡因子Bcl-xl蛋白和基因的表達(dá)，保護(hù)了線粒體功能，減少細(xì)胞色素C和AIF的釋放，及阻止Caspase蛋白酶的活性，從而起到抑制心肌細(xì)胞凋亡，提高心功能的作用。四逆湯是我國(guó)的經(jīng)典名方，銀杏葉提取物是目前公認(rèn)的抗氧化藥物，我們的研究為應(yīng)用四逆湯等中藥進(jìn)行阿霉素性心肌毒性的心肌保護(hù)治療提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。 結(jié)論

15、： 1.本實(shí)驗(yàn)中的心力衰竭模型存在有明顯的心肌組織和線粒體氧化應(yīng)激狀態(tài)，及心肌細(xì)胞的凋亡。相關(guān)分析表明，心衰時(shí)心功能的下降與機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)和心肌細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。線粒體損傷，細(xì)胞色素C，AIF等蛋白釋放，Caspase-9、Caspase-3蛋白酶的激活在心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生中有重要作用。 2.四逆湯可以明顯改善阿霉素性心力衰竭大鼠的癥狀和體征，提高心功能，降低心肌組織及線粒體的氧化損傷，提高機(jī)體抗氧化酶Cu-ZnSO

16、D和MnSOD的基因表達(dá)和蛋白活性，抑制心肌細(xì)胞凋亡。 3.四逆湯對(duì)抗阿霉素性心力衰竭心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)保護(hù)線粒體功能，減少細(xì)胞色素C和AIF的釋放，及阻止Caspase-9、3蛋白酶的激活，提高抗凋亡基因Bcl-xl的基因和蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 4.在本實(shí)驗(yàn)條件下，抗氧化藥物銀杏葉提取物具有明顯的抗阿霉素性心力衰竭的作用，其提高心功能，保護(hù)心肌細(xì)胞的作用機(jī)制也可能是通過(guò)改善機(jī)體的抗氧化功能，保護(hù)線粒體，減少線粒

17、體途徑誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。四逆湯具有與其相類(lèi)似的抗心衰作用。 創(chuàng)新點(diǎn)：1.探索了氧化應(yīng)激-線粒體損傷-細(xì)胞凋亡在阿霉素性心肌毒性造成的心力衰竭中的作用。 2.從抗氧化應(yīng)激的角度出發(fā)，探索了中藥方劑四逆湯對(duì)阿霉素性心力衰竭心肌細(xì)胞及其線粒體的保護(hù)作用。 3.從線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑入手，闡釋了四逆湯抗阿霉素性心力衰竭心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 4.進(jìn)行四逆湯作用研究的同時(shí)，亦以線粒體為中心，在蛋白和基因