酶法提取光皮木瓜中的多酚類物質(zhì)及其抗氧化作用研究.pdf

1、近幾年來，在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，抗氧化劑研究的重要性日益引起人們的關(guān)注。一些由于氧化應(yīng)激引起或促進的心腦血管疾病，腫瘤和機體失調(diào)，如糖尿病和風(fēng)濕病，大多都與衰老有關(guān)。雖然這些疾病形成的機理非常復(fù)雜，但逐漸被意識到的是，膳食或某些膳食因子的攝入在預(yù)防和治療這些疾病的過程中發(fā)揮著不可忽視的作用。導(dǎo)致這類疾病的原因主要是過度“西化”的生活方式，如精制的富含飽和脂肪酸的膳食以及糖攝入過高，而植物纖維素，礦物質(zhì)和維生素攝入過低。 然而，長時間

2、以來被認(rèn)為毫無營養(yǎng)價值的天然植物化合物，逐漸引起了人們極大的興趣。植物化合物是一類植物的次生代謝物，它們能夠使抵御微生物的進攻，還能作為信號傳導(dǎo)物質(zhì)等。多酚就是這樣的一大類植物化合物。它們存在于許多水果、蔬菜、堅果、種子、花朵、樹皮、飲料，以及作為天然成份存在于一些商業(yè)食品之中。多酚由于其顯著的保健作用而成為研究的焦點。有報道稱多酚能夠抗腫瘤，抗動脈粥樣硬化，抗?jié)?，抗血栓形成，抗炎癥免疫調(diào)節(jié)，抗菌，擴張血管，止痛的作用。 光皮

3、木瓜為薔薇科植物帖梗海棠[Chaenomeles.speciosa(sweet)Nakai]的成熟果實，主要分為兩大類：皺皮木瓜(川木瓜、云木瓜、藏木瓜、日本木瓜等)和光皮木瓜(山木瓜)，本實驗所用材料為光皮木瓜(Chinesequince,CQ)屬于木瓜同科植物榠楂[Chaenomeles.sinesis(Touin)Koehne]，是我國傳統(tǒng)的中藥材。它具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)的功效。據(jù)報道，光皮木瓜含有豐富的膳食纖維和有機酸，特別是

4、含有大量的有潛力的抗氧化劑。國內(nèi)外關(guān)于光皮木瓜中多酚類物質(zhì)和抗氧化能力的報道很少，而國內(nèi)多為木瓜飲片中簡單成份的分析。本項研究首先采用單因素結(jié)合多因素正交分析，加入纖維素酶解的新工藝，觀察了溫度、時間、pH：值等因素對多酚提取的影響，對CQ中多酚類物質(zhì)的提取工藝進行了優(yōu)化組合；其次采用分光光度法對CQ中多酚類物質(zhì)的組成成份進行分析，并考察了不同采摘時期的CQ中多酚類成份含量及其組成比例的變化；采用聚酰胺薄層色譜法，利用不同展開劑和顯色劑

5、，分離純化光皮木瓜多酚(PolyphenolsfromChinesequince，PCQ)，并用不同顯色劑，在可見、紫外光、凝膠成像儀中下觀察，對分離成份做定性分析；運用SephadexLH-20葡聚糖凝膠層析技術(shù)對PCQ中的單寧進行純化分離，并結(jié)合薄層色譜法鑒定其分離結(jié)果；體外：DPPH.自由基清除試驗測試PCQ提取物的抗氧化活性，并觀察多酚的動力學(xué)反應(yīng)及其EC50，對PCQ的體外抗氧化活性進行綜合評價；按照《保健食品功能評價規(guī)范》抗

6、氧化功能測試的標(biāo)準(zhǔn)，同時建立D-gal和輻照小鼠過氧化模型，觀察兩者建立的難易程度，以獲得更適合本試驗的動物模型；成功建立動物模型后，將動物分組，以試驗所得的PCQ提取物喂養(yǎng)小鼠，試驗結(jié)束后，取小鼠血清，心、肝、腎、腦組織，測定其中MDA和SOD含量，評價PCQ的體內(nèi)抗氧化效應(yīng)。旨在全面系統(tǒng)的分析CQ中的多酚類物質(zhì)，并結(jié)合體內(nèi)外試驗對PCQ的抗氧化效應(yīng)做出綜合評價，為光皮木瓜這一我國寶貴的傳統(tǒng)資源的深度開發(fā)打下理論基礎(chǔ)。 本研究

7、主要試驗結(jié)果如下： 1.采用溶劑提取結(jié)合纖維素酶解工藝提取CQ中的多酚類物質(zhì)，單因素考察提取溶劑、提取次數(shù)、酶添加量、溫度、pH值和時間對PCQ提取的影響，正交分析了酶添加量、溫度、pH值和時間4個因素對PCQ提取的影響，并對比了酶解工藝前后多酚含量的變化。研究發(fā)現(xiàn)，50％乙醇做為提取溶劑、提取兩次、纖維素酶添加量為1.0％、50℃、pH值調(diào)為4.5、提取時間30min后，PCQ能夠得到最大提取率；正交實驗表明對PCQ提取率影響

8、的順序為：溫度＞酶添加＞時間＞pH值，結(jié)合單因素實驗結(jié)果，提取最佳工藝為酶添加量為1％，酶解溫度55℃，pH值4.0，酶解時間30min；纖維素酶對多酚提取率影響顯著，酶解前后的水提物(酶解前Cs，酶解后CEs)多酚含量提高了10.84％，醇提物(酶解前Cr，酶解后CEr)中多酚含量提高了41.72％。本研究顯示，酶解的方法對Cr的影響較Cs大，總的來說，酶解方法能夠顯著提高多酚的提取率。 2.采用分光光度法測定了PCQ粗提物中

9、總酚、單寧和黃酮的含量，并觀察了不同成熟期PCQ成份，分析了其中成份含量及組成比例的變化。研究發(fā)現(xiàn)，Cs中總酚含量為586mg/100gFW(Freshweight)，Cr1215mg/100gFW，總多酚含量為二者之和1801mg/100gFW；Cs中單寧含量為217mg/100gFW，Cr中為718mg/100gFw，總單寧含量為935mg/100gFw，約占總酚含量的51.93％；Cs中黃酮類含量為294mg/100gFW，Cr中

10、為289mg/100gFW，總黃酮為583mg/100gFW，占總酚含量的32.39％。6月份的幼果果肉中有較高的多酚含量，7月份果肉中的多酚含量迅速下降，其后8、9月份下降速度逐漸變緩，最后則基本穩(wěn)定或稍有下降；CQ果實發(fā)育過程中原花色素，黃酮與總酚含量的變化趨勢基本相似，其他酚類如酚酸等單體物質(zhì)則呈現(xiàn)出含量升高的趨勢，至后期趨于平緩；果實發(fā)育初期，原花青素為果肉中主要的多酚物質(zhì)，占總酚含量的50％以上，而黃酮和其他酚類分別占38％和

11、16％，其后隨著果實的發(fā)育，原花青素和黃酮類占比例逐漸降低，而其他酚類所占比例逐漸上升，至后期，各組含量變化趨于平緩成熟時原花青素占總酚含量的比例降至39％，黃酮含量的比例為32％，其他酚類所占比例升至27％。 3.采用聚酰胺薄層色譜法對PCQ粗提液中的多酚單體成份進行鑒定，SephadexLH-20葡聚糖凝膠層析柱分離純化其中的單寧，并用薄層色譜鑒定分離結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，PCQ與GSP成份較為相似，多酚中含有大分子的單寧以及不同

12、聚合程度的原花青素，初步判斷PCQ中有兒茶素、綠原酸、槲皮素以及蘆丁單體存在，且綠原酸含量依次為Cd＞CEs＞CEr。95％乙醇洗脫液主要洗脫下了非單寧類的酚類物質(zhì)，疑為二氫黃酮類，70％丙酮洗脫液主要洗脫了單寧，薄層鑒定分離效果較好。 4.采用DPPH.清除實驗考察PCQ粗提液的體外抗氧化能力，包括PCQ與DPPH.反應(yīng)的動力學(xué)研究，抗氧化能力ECso和ARP值，并對比了不同多酚粗提液的清除DPPH.的能力。研究發(fā)現(xiàn)，Cs，C

13、Es，Cr，CEr與DPPH.反應(yīng)均能較快地達(dá)到平衡，其中Cs較Cr反應(yīng)速度快；Cs，CEs，Cr，CEr均有較強的清除：DPPH.的能力；Cs和Cr的EC50分別為0.045mg/ml和0.072mg/ml，酶解后分別為0.040mg/ml和0.058mg/ml，均非常顯著的減小；酶解工藝的加入增強了PCQ粗提物的DPPH.清除效應(yīng)，特別是Cr的有非常顯著的提高，從ARP值來看，抗氧化性能依次為：CEs(25)＞Cs(22.22)＞C

14、Er(17.24)＞Cr(13.89)。 5.采用給小鼠腹腔連續(xù)注射D-半乳糖連續(xù)的方法和60Coγ射線全身1次性輻照小鼠兩種方法制造過氧化損傷模型，選取適合模型進行PCQ粗提液的體內(nèi)抗氧化效應(yīng)實驗，測定小鼠血清和組織中的MDA含量和SOD活性。研究發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖法造模所需時間較長，比較麻煩，且效果不甚明顯。而60Coγ射線輻照法建立過氧化損傷模型較成功，簡單、快速且效果好；各劑量組與模型對照組相比，血清和組織中MDA含量均有

15、不同程度的降低，SOD活性則有不同程度的提高，其中一些劑量組與模型組對比有顯著性或極顯著差異。結(jié)果顯示，PCQ粗提液具有較強的抗氧化能力。 綜上所述，本課題研究得到了PCQ提取的最佳工藝。測定了多酚的組成成份，明確了總酚、單寧和黃酮類大致含量，并考察了不同采摘時期PCQ的分布情況。初步鑒定了幾種多酚單體，并成功分離純化得到單寧。體外實驗表明PCQ粗提液具有較強抗DPPH·效應(yīng)。成功建立輻照小鼠過氧化損傷模型，體內(nèi)實驗表明，PCQ