棉纖維發(fā)育相關(guān)EST-SSR的特征、功能及其定位.pdf

1、為了增加微衛(wèi)星標(biāo)記用于構(gòu)建飽和的棉花分子遺傳圖譜，以及將功能基因組學(xué)用于棉纖維發(fā)育機(jī)理的解析和棉花遺傳育種，本研究從大量的亞洲棉和陸地棉纖維發(fā)育相關(guān)EST中開(kāi)發(fā)SSR引物，并且分析了SSR的特征、功能、海陸間的多態(tài)性以及在四倍體棉種At和Dt亞組的分布特征。 從來(lái)源于亞洲棉開(kāi)花后7～10天纖維cDNA文庫(kù)的1187條EST，設(shè)計(jì)了763對(duì)EST-SSR引物，其中包含簡(jiǎn)單sSR 605條，復(fù)合ssR 158條。605條EST中，六

2、核苷酸和三核苷酸比例最高，分別占到36％和31.3％，二核苷酸重復(fù)占20.4％，五核苷酸重復(fù)占7.9％，四核苷酸重復(fù)占4.6％。在包含簡(jiǎn)單SSR的605條EST的核苷酸重復(fù)基元中，二核苷酸重復(fù)中比例最高的是AT/TA，占12.6％。763對(duì)EST-SSR引物中687(90％)對(duì)可以在異源四倍體陸地棉TM-1和海島棉海7124中得到擴(kuò)增產(chǎn)物。其中有120對(duì)引物可以在這兩個(gè)材料間產(chǎn)生多態(tài)帶型，用于遺傳作圖。120對(duì)EST-SSR引物總共得到

3、143個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，通過(guò)作圖軟件，將其中的135個(gè)整合到了已有的包含511個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳圖譜中。從這些135個(gè)位點(diǎn)的分布情況來(lái)看，并不是隨機(jī)的，因?yàn)橛?4個(gè)分布在染色體At亞組，51個(gè)在Dt亞組。 利用構(gòu)建的7235 5～25天的纖維和徐州142開(kāi)花后0～5天的胚珠以及3～22天后纖維的cDNA文庫(kù)，隨機(jī)測(cè)序得到13505條EST，去掉冗余之后為5811條。其中966條包含一個(gè)以上微衛(wèi)星(SSR)。根據(jù)EST-SSR引物設(shè)計(jì)的

4、標(biāo)準(zhǔn)，共得到489對(duì)EST-SSR引物。在這部分EST中，三核苷酸重復(fù)最多，占59.1％；然后是二核苷酸重復(fù)，占30％；四核苷酸重復(fù)占6.4％；六核苷酸重復(fù)占2.7％；最少的是五核苷酸重復(fù)，占1.8％。在所有的重復(fù)基元中，AT/TA占的比例最高，約為18.4％，其余的依次為CTT/GAA(5.3％)，AG/TC(5.1％)，AGA/TCT(4.9％)，AGT/TCA(4.5％)，AAG/TTC(4.5％)等。489對(duì)引物在作圖親本TM-

5、1和海7124間存在多態(tài)的共114對(duì)，產(chǎn)生130個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。其中129個(gè)位點(diǎn)整合到現(xiàn)有的遺傳圖譜上，有66個(gè)分布在染色體At亞組，63個(gè)在Dt亞組。 在從Genbank dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)下載來(lái)源于陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的-3～3dpa胚珠的32190條EST中，去冗余之后為12463條，利用SSRIT和Primer3設(shè)計(jì)得到454對(duì)EST-SSR引物。這些EST重復(fù)基元中，六核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)最多，分別占47.3％和38

6、.8％，二、四、五核苷酸重復(fù)分別占7.5％、3.2％、3.2％。所有的核苷酸重復(fù)基元中，三核苷酸AGA/TCT所占比例最高，約占4.3％；二核苷酸重復(fù)中，比例最高的是AG/TC，占2.6％；四核苷酸重復(fù)中，AAAC/TTTG比例最多，占約1.5％：五核苷酸和六核苷酸重復(fù)中，CCCAA和CCACCT/GGTGGA所占比例最高，分別是0.4％和1.1％。454對(duì)引物擴(kuò)增海陸B(tài)C<,1>作圖群體親本TM-1和海7124，總共84對(duì)產(chǎn)生多態(tài)條帶

7、，可以進(jìn)行定位研究。84對(duì)引物擴(kuò)增共存在90個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。其中84個(gè)位點(diǎn)(包括8個(gè)偏分離位點(diǎn))能夠整合到該作圖群體的遺傳框架圖上。84個(gè)位點(diǎn)分布在26條染色體上，有40個(gè)分布在染色體At亞組，44個(gè)分布在染色體Dt亞組。 616對(duì)MUSS/2VIUCS EST-SSR引物擴(kuò)增共有22對(duì)產(chǎn)生多態(tài)條帶。產(chǎn)生23個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。其中有22個(gè)位點(diǎn)(包括3個(gè)偏分離位點(diǎn))可以整合遺傳框架圖上。四倍體棉花基因組的At和Dt亞組各分布11個(gè)多態(tài)位點(diǎn).

8、 從亞洲棉和陸地棉的87154條EST序列中，利用blastclust軟件得到非冗余序列39507條，總長(zhǎng)度為28005.9kb，其中二～六核苷酸重復(fù)大于等于18bp的SSR共有2146個(gè)，平均每13.05kb出現(xiàn)一個(gè)SSR。所有的重復(fù)類型中，六核苷酸重復(fù)最多，占36.8％；AT/TA比例最高，占7.4％。 在本研究得到的386個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)中，有24對(duì)EST-SSR引物擴(kuò)增得到的重復(fù)位點(diǎn)分布在相應(yīng)的部分同源染色體上。有16

9、對(duì)EST-SSR引物產(chǎn)生的重復(fù)位點(diǎn)分布在非部分同源染色體或同一染色體。整合后的圖譜包含1052個(gè)位點(diǎn)，圖距總計(jì)6321cM，平均兩個(gè)位點(diǎn)間的距離為6.0 cM。其中A3、A11、D1和D11染色體各包括兩個(gè)連鎖群。每條染色體上的標(biāo)記數(shù)目從22-58不等，圖距從144.5-383.5 cM。整合到遺傳圖譜上的43個(gè)偏分離EST-SSR標(biāo)記中，偏向親本TM-1的有22個(gè)，偏向海7124的有21個(gè)。 利用Blast2go軟件，將已知功

10、能的EST按照細(xì)胞組分、分子功能和生物進(jìn)程分為三大類。在細(xì)胞組分一類中，大多數(shù)被歸為細(xì)胞(cell，41％)和細(xì)胞器(organelle，36％)兩類；分子功能的分類中，催化活性(catalytic activity)和結(jié)合(binding)各約占22％和24％；在第三分類生物進(jìn)程中，大部分歸為生理進(jìn)程(physiological process，38％)或細(xì)胞進(jìn)程(cellular process，36％)。 本研究將部分糖代

11、謝相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因定位到染色體，如蔗糖合酶定位到了A6染色體上，E6定位到A5和D5染色體，MYB60定位到A13染色體等。另外，A8染色體上定位了一個(gè)耐鹽蛋白基因NAu920。 針對(duì)棉花遺傳圖譜的研究已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種分子標(biāo)記，但是根據(jù)棉花已克隆的基因開(kāi)發(fā)的SNP標(biāo)記相對(duì)較少。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出陸地棉TM-1和海島棉海7124中基因FbL2A的序列，分析了材料間存在的單核苷酸多態(tài)性(sNPs)。根據(jù)TM-1和海

12、7124兩個(gè)材料中FbL2A基因的測(cè)序結(jié)果，采用NEBcutter軟件分析，選擇BstUI內(nèi)切酶酶解擴(kuò)增產(chǎn)物，利用Mapmakerv3.0作圖軟件將FbL2A基因定位到D2染色體。 FIF1基因是棉纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)的一個(gè)基因，研究證明它可能在棉纖維的發(fā)育過(guò)程中起著很重要的調(diào)控作用。根據(jù)已發(fā)表的亞洲棉FIF1基因，設(shè)計(jì)特異引物，克隆了陸地棉TM-1和海島棉海7124中FIF1基因。根據(jù)兩個(gè)四倍體棉花FIF1基因的SNP變異，采用SNA