基于CMCS-PEI雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體的制備和評價(jià).pdf

1、納米技術(shù)在共遞送化療藥物和基因治療惡性腫瘤中顯示良好的應(yīng)用前景，改善了藥物遞送過程中穩(wěn)定性低、溶解度小、選擇性差等問題。然而有效推動共遞送基因和化療藥物納米載體走向臨床仍需不斷努力。pH敏感共遞送藥物和基因納米載體以其可控釋藥的優(yōu)勢成為近年研究熱點(diǎn)。pH敏感共遞送抗癌藥和基因納米載體可簡單利用腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體酸性環(huán)境實(shí)現(xiàn)藥物和基因可控遞送，從而降低毒副作用并提高治療效果。腫瘤微環(huán)境pH敏感共遞送化療藥物和基因納米載體在血液循環(huán)

2、中穩(wěn)定存在，到達(dá)酸性腫瘤組織后，外殼pH敏感性脫落，暴露功能化內(nèi)核并被腫瘤細(xì)胞攝取，增加胞內(nèi)有效藥物濃度，提高抗腫瘤效果;內(nèi)吞體/溶酶體pH敏感納米載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)吞體/溶酶體后，在酸性pH誘導(dǎo)下可迅速釋放藥物，到達(dá)胞內(nèi)可控釋藥目的。然而，隨著研究不斷深入，更為精確控制藥物釋放以及增加胞內(nèi)有效藥物濃度問題受到廣泛關(guān)注。利用腫瘤微環(huán)境pH(6.0～7.0)低于正常組織pH(7.4)，內(nèi)吞體/溶酶體pH(4.5～6.5)低于胞漿pH(7.4)

3、，設(shè)計(jì)一種在腫瘤微環(huán)境和溶酶體/內(nèi)吞體酸性環(huán)境中程序性響應(yīng)地雙pH敏感共遞送藥物和基因納米載體可實(shí)現(xiàn)藥物和基因更為精確控制釋放并增加胞內(nèi)有效藥物濃度。
　　本課題采用功能集成組裝技術(shù)構(gòu)建腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體，以期實(shí)現(xiàn)化療藥物和基因更為可控地遞送。選取目前最為有效的聚陽離子基因載體聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)作為內(nèi)核材料共遞送化療藥物DOX和基因。采用內(nèi)吞體/溶酶

4、體pH響應(yīng)性裂解腙鍵連接DOX和PEI，合成了胞內(nèi)pH敏感載藥材料DOX-PEI(DP)。O-羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl-chitosan，CMCS)生物相容性良好，且CMCS在pH高于7.0時(shí)荷負(fù)電而在pH低于6.5時(shí)荷正電?；诖耍铣闪艘訬GR為靶向因子的腫瘤微環(huán)境pH敏感材料CMCS-PEG-NGR(CPN)。基于以上功能化DP和CPN，可組裝腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體CPN

5、/DP/pDNA(CPN/DPD，CDPD)。DP作為一種陽離子聚合物，可有效壓縮荷負(fù)電的pDNA分子形成DP/pDNA復(fù)合物(DPD)，實(shí)現(xiàn)藥物和基因的共同裝載。制備的內(nèi)吞體/溶酶體pH敏感共遞送DOX和pDNA納米載藥DPD，DPD內(nèi)核表面帶正電荷，在生理?xiàng)l件下(pH7.4)吸附荷負(fù)電CPN，形成腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體CPN/DPD(CDPD)。CDPD經(jīng)給藥后將在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在，到達(dá)腫瘤

6、部位后，NGR介導(dǎo)轉(zhuǎn)胞吞作用在腫瘤組織蓄積。腫瘤微環(huán)境pH誘導(dǎo)CPN由負(fù)電荷逆轉(zhuǎn)為正電荷并從CDPD表面脫落（第一重pH敏感），暴露DPD內(nèi)核。DPD表面正電荷可有效促進(jìn)細(xì)胞攝取作用，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的DPD輸送到內(nèi)吞體/溶酶體，經(jīng)內(nèi)吞體/溶酶體酸性pH誘導(dǎo)，腙鍵斷裂并迅速釋放DOX（第二重pH敏感），由于PEI“質(zhì)子海綿”效應(yīng)產(chǎn)生溶酶體逃逸作用，PEI/pDNA和DOX釋放進(jìn)入胞漿，并發(fā)揮相應(yīng)抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)中以編碼綠色熒光蛋白的pDNA

7、為模型基因，考察CDPD在模擬腫瘤微環(huán)境pH和內(nèi)吞體/溶酶體pH條件下CPN響應(yīng)性脫落以及DOX和pDNA程序釋放。探究CDPD作為腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體可能性，為進(jìn)一步抗腫瘤研究奠定基礎(chǔ)。
　　為進(jìn)一步探究腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體優(yōu)勢并提高胞內(nèi)有效藥物和基因濃度，提高癌癥治療效果。利用TAT肽作為一種經(jīng)典陽離子細(xì)胞穿透肽，以PEG共同連接TAT和PEI

8、，合成了具有促進(jìn)穿細(xì)胞膜作用材料PEI-PEG-TAT(PPT)。同時(shí)選定腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體質(zhì)粒(plasmid tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligands，pTRAIL)為治療基因。采用DP和PPT摻和壓縮制備胞內(nèi)pH敏感的促細(xì)胞攝取PPT/DP/pTRAIL(PDT)，制備的PDT內(nèi)核包裹CPN后形成腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞雙促進(jìn)的腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體

9、雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體CPN/PDT(CPDT)。以期待制備的CPDT除具有腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感特性實(shí)現(xiàn)更為可控藥物和基因釋放外，到達(dá)腫瘤組織后由于NGR介導(dǎo)轉(zhuǎn)胞吞作用在腫瘤部位蓄積（第一重促進(jìn)作用），腫瘤組織pH誘導(dǎo)CPN脫落后暴露的PDT內(nèi)核由于TAT介導(dǎo)穿細(xì)胞膜（第二重促進(jìn)作用），增加胞內(nèi)有效藥物和基因濃度。實(shí)驗(yàn)過程中對PPT促進(jìn)細(xì)胞攝取PDT能力進(jìn)行考察并確定最優(yōu)處方，對PDT體外抗增殖作用進(jìn)行考察

10、，同時(shí)采用Western Blot分析TRAIL蛋白表達(dá)。為雙pH敏感共遞送載體進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本課題主要研究腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感納米載體作為共遞送載體可能性以及腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感納米載體共遞送化療藥物DOX和治療基因pTRAIL體外抗腫瘤效果。為腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，本課題主要研究方法和結(jié)果如下:
　　1 DO

11、X含量測定方法學(xué)考察
　　采用紫外分光光度法測定DOX在pH5.0和pH7.4的PBS中含量，并對方法學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明此方法簡便快速且專屬性好，在pH5.0和pH7.4的PBS中，DOX濃度在0.05～100μg/mL范圍內(nèi)與吸光度(A)呈良好線性關(guān)系。精密度和回收率均符合規(guī)定。
　　2雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體構(gòu)建和評價(jià)
　　功能化材料的合成是腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載

12、體構(gòu)建的基礎(chǔ)。本課題合成DP和CPN，核磁圖譜驗(yàn)證結(jié)構(gòu)?；诠δ芑疍P和CPN，采用功能集成組裝技術(shù)構(gòu)建胞內(nèi)pH敏感DPD和腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感CDPD。選定DP/pDNA最優(yōu)質(zhì)量比為25∶4制備DPD，同時(shí)選定CPN/pDNA最優(yōu)質(zhì)量比為25∶8制備CDPD。DPD和CDPD外觀形態(tài)圓整，呈球形和類球形。DPD和CDPD平均粒徑分別為80.0±4.2 nm和137.4±2.7 nm，Zeta電位分別為23.59±2.5

13、9 mV和8.25±2.43 mV。體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在儲存條件下DPD比CDPD納米粒穩(wěn)定性好，DPD和CDPD納米粒在4℃條件下儲存一周后平均粒徑分別增加了約33.35 nm和83.02 nm，在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中CDPD比DPD穩(wěn)定性好，DPD和CDPD在37℃與含10％ FBS的DMEM孵育24 h后平均粒徑分別增加了約226.48 nm和36.6 nm。體外攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CDPD納米在CD

14、13陽性A549中攝取率(92.49±2.28％)要高于其在CD13陰性HepG2細(xì)胞中攝取率(67.82±0.07％，p＜0.05)。不同pH條件下體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值從7.4降低到6.0，CDPD在HepG2細(xì)胞上轉(zhuǎn)染效率逐漸增高，表明在模擬腫瘤微環(huán)境pH條件下(pH6.0)，CPN可從CDPD納米粒表面完全脫落。脫落CPN外殼的DPD內(nèi)核在模擬內(nèi)吞體/溶酶體環(huán)境中（0.1M的pH5.0PBS）孵育4h后，可完全釋放DOX并

15、保護(hù)pDNA免受破壞。共遞送實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CDPD到達(dá)腫瘤部位后暴露DPD內(nèi)核并有效共遞送DOX和pDNA進(jìn)細(xì)胞。3雙促進(jìn)雙pH敏感共遞送DOX和pTRAIL納米載體的構(gòu)建和評價(jià)
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證腫瘤微環(huán)境和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體優(yōu)勢，并提高胞內(nèi)有效藥物濃度，殺死腫瘤細(xì)胞。合成了促進(jìn)穿細(xì)胞膜PPT，并選定pTRAIL為治療基因。采用DP和PPT摻和壓縮pTRAIL制備腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞雙促進(jìn)的腫瘤微環(huán)境

16、和內(nèi)吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和pTRAIL納米載體內(nèi)核PPT/DP/pTRAIL(PDT)。瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPT、DP和C6-SANH-PEI材料具有相似的壓縮基因能力，均能夠在質(zhì)量比為25∶16時(shí)將pTRAIL完全壓縮。選定最優(yōu)處方為混合材料與pTRAIL質(zhì)量比為25∶4，混合材料中PPT占30％。制備的PDT外觀圓整，呈類球形，平均粒徑為80.29±3.66 nm。與游離DOX以及只載pTRAIL納米載體(P

17、PT/C6-SANH-PEI/pTRAIL，PCT)比較，PDT能夠顯著提高在HepG2和A549細(xì)胞上的體外抗腫瘤效果。同時(shí)Western Blot分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDT能夠很好地轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，提高蛋白表達(dá)量。因此制備的雙促進(jìn)雙pH敏感共遞送DOX和pTRAIL納米載體CPN/PDT(CPDT)具備腫瘤細(xì)胞內(nèi)外雙重敏感的同時(shí)，也具腫瘤部位和腫瘤細(xì)胞雙重促進(jìn)作用，因此CPDT除以一種更為可控的方式釋放藥物和基因，還可有效增加胞內(nèi)