AIDS患者CCR5、CXCR4輔助受體的利用及表達(dá).pdf

1、研究背景:人類免疫缺陷病毒Ι型（HIV-1）是目前全球HIV主要流行毒株,M組內(nèi)9個(gè)亞型已經(jīng)被確定，分別被定名為A-D、F-H、J和K。一些亞型歸屬于O組，只有幾個(gè)毒株屬于N組。近年來又發(fā)現(xiàn)CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF02_AG、CRF12_BF等多個(gè)重組型流行株，截至目前在數(shù)據(jù)庫內(nèi)正式命名重組亞型已經(jīng)多達(dá)72個(gè)。在我國主要流行的HIV-1毒株有CRF01_B、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF0

2、8_BC。
　　1996年研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HIV感染宿主細(xì)胞時(shí)，除了與宿主細(xì)胞的CD4受體結(jié)合，還必須識別宿主細(xì)胞膜上的CXCR4或/和CCR5協(xié)同受體才能進(jìn)入細(xì)胞，HIV進(jìn)入細(xì)胞時(shí)必須與其中一種輔助受體結(jié)合才能感染CD4細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)被譽(yù)為HIV研究中新的里程碑，也使通過藥物阻斷HIV-1識別受體成為艾滋病治療的突破口。根據(jù)進(jìn)入細(xì)胞利用不同的輔助受體，可以分為R5型（CCR5輔助受體）和X4型（CXCR4輔助受體），以及雙嗜性病毒（

3、CCR5和CXCR4共受體），而HIV選擇哪種輔助受體與HIV型別、感染途徑、病程、治療情況、病情預(yù)后密切相關(guān)。2007年美國FDA批準(zhǔn)用于臨床治療HIV感染的R5拮抗劑是小分子拮抗劑，可以封閉R5的ECL阻斷HIV結(jié)合，可見R5拮抗劑開始受到重視。HIV-Env外膜蛋白的gpl20 V3環(huán)的基因序列直接影響輔助受體的選擇。V3環(huán)氨基酸序列變異率高，其頂端的四肽基序GPGR具有重要的免疫原性,其中任何一個(gè)氨基酸的改變都可影響輔助受體的利

4、用。目前國際上通過軟件對四肽基序利用輔助受體的情況進(jìn)行評估以預(yù)測臨床療效及預(yù)后。本文對廣州地區(qū)HIV-1主要流行亞型的HIV-Env外膜蛋白的gpl20 V3環(huán)的基因序列進(jìn)行測序分析，并聯(lián)合多種在線生物信息學(xué)工具分析病毒株利用CCR5和CXCR4輔助受體的情況。并研究CCR5、CXCR4在相應(yīng)的HIV/AIDS患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)。國外研究發(fā)現(xiàn)CCR5受體呈陰性或數(shù)量減少的人不易發(fā)生HIV感染或病情

5、進(jìn)展較慢，因此以CCR5受體為藥物作用靶點(diǎn)抗HIV藥已經(jīng)問世并已投入臨床。也有研究發(fā)現(xiàn)從新感染人群分離的HIV主要使用CCR5并且這些R5病毒株可在HIV感染整個(gè)過程中被檢測到。X4病毒株絕大多數(shù)在疾病晚期出現(xiàn)，伴隨著低CD4計(jì)數(shù)和高病毒載量。在這些病人中僅僅占50％。CCR5和CXCR4都屬于趨化因子受體都表達(dá)在白細(xì)胞，CXCR4主要是靜止及幼稚T細(xì)胞，發(fā)生HIV感染時(shí)，HIV包膜蛋白gp120先與CD4受體結(jié)合，再與CCR5或CXC

6、R4受體結(jié)合，使HIV進(jìn)入CD4+T淋巴細(xì)胞。HIV與細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)HIV在從HIV-R5株變?yōu)镠IV-X4株時(shí)受體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了變異，以適應(yīng)新選擇的受體X4，這一變化過程是否與R5受體的下調(diào)有關(guān)，因此研究病毒嗜性與R5、X4受體表達(dá)的相關(guān)性研究是有必要的。
　　第一部分分析廣東省不同亞型AIDS患者HIV-gpl20 V3環(huán)基因變異及其利用輔助受體的情況
　　目的：本研究旨在了解廣東省HIV-1主要流行亞型及V

7、3環(huán)氨基酸變異特點(diǎn)，并聯(lián)合多種在線生物信息學(xué)工具分析病毒株利用CCR5和CXCR4輔助受體的情況。
　　方法：收集2013年-2014年期間在廣州市第八人民醫(yī)院住院的AIDS患者血漿232例，巢式聚合酶鏈反應(yīng)（Nested-PCR）方法擴(kuò)增env外膜蛋白基因C2-C3(HBX2:6972-7365)區(qū)，其中涵蓋了V3區(qū)序列。PCR產(chǎn)物回收測序，基因序列用Geen tool翻譯為氨基酸序列進(jìn)行比對、軟件分析。
　　結(jié)果：

8、>　　1.214例結(jié)果納入分析:所有樣本各基因亞型比例:共有214例擴(kuò)增出來，HIV分型結(jié)果顯示，214例樣本基因分型中143例（66.8%）為CRF01_AE；45例（21.0%）為CRF_BC；26例（12.2%）為B亞型。
　　不同亞型毒株中頂端四肽類型分布也有所差異，在所有亞型中共發(fā)現(xiàn)8種V3環(huán)頂端四肽類型，其中主要類型為GPGQ、GPGR，分別占總樣本的73.36%（157/214）和11.68%（25/214），同時(shí)也

9、發(fā)現(xiàn)了較為罕見的GPGG GLGH GPGS和GPGH類型為3.74%（8/214），其次是GPGK8.88%（19/214）、GQGQ2.34%（5/214）。CRF_BC頂端四肽分布主要為GPGQ，所占比例分別為93.75%（30/32）、100%（2/2）、81.82%（9/11），而CRF01-AE表現(xiàn)出多形態(tài)分布，有74份具有GPGQVF，此為泰國CRF_01AE毒株V3環(huán)的典型序列。
　　2.輔助受體預(yù)測:使用國際上普

10、遍應(yīng)用的4種軟件：PSSM/x4r5、SAAC+BLAS、 PSSMsisi、Geno2pheno[coreceptor]分別對V3環(huán)頂端四肽基序利用輔助受體的情況進(jìn)行評估，結(jié)果顯示：利用CCR5輔助受體分別為72.43%（155/214）、48.13%（103/214）、72.89%（156/214）、58.41%（125/214），利用CXCR4輔助受體分別為27.57%（59/214）、51.87%（111/214）、27.10%

11、（58/214）、41.12%（88/214），p值=1.60*10-8〈0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4種軟件綜合評估結(jié)果顯示131例（68.24%）利用CCR5輔助受體；71例（31.76%）利用CXCR4輔助受體；12例無評估結(jié)果，其中10例為CRF01_AE，1例為B亞型。研究還發(fā)現(xiàn)：32例CRF_BC亞型的V3四肽基序單一使用PSSMsisi軟件的評估結(jié)果與4種軟件綜合評估結(jié)果的一致率為100%。
　　在CRF01_AE中

12、利用CCR5輔助受體為60.47%（78/129），占所有利用CCR5輔助受體58.65%（78/133），利用CXCR4輔助受體39.53%（51/129），在CRF_BC中分別為91.1%（41/45）9.9%（4/45），CRF01_AE毒株X4嗜性的比例與其他亞型毒株做顯著性檢驗(yàn)p值=1.60*10-8〈0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：目前廣東省HIV-1的主要流行株仍是CRF01_AE，其V3環(huán)氨基酸高度變異,頂

13、端四肽基序主要是GPGQ，對其利用CCR5或CXCR4輔助受體的情況宜采取國際普遍使用的4種軟件進(jìn)行綜合分析，CRF01_AE亞型與其它亞型患者相比X4嗜性占有的比例較高，提示應(yīng)早期開始抗病毒治療。
　　第二部分不同病毒嗜性淋巴細(xì)胞表面第二受體的表達(dá)研究
　　目的:研究人外周血CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞表面趨化因子受體5（R5）和趨化因子受體4（X4）的表達(dá)，比較健康人群與AIDS病患者的CCR5和CXCR4表達(dá)的差異，

14、并通過聯(lián)合多種在線生物信息學(xué)工具研究AIDS病患者V3環(huán)氨基酸變異及病毒嗜性，比較不同病毒嗜性CCR5和CXCR4輔助受體的表達(dá)情況。
　　方法：收集63例HIV/AIDS患者的抗凝全血及血漿并以14例健康志愿者的抗凝全血做對照，用流式細(xì)胞儀檢測該77例樣本CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上第二受體CCR5、CXCR4的表達(dá)。巢式聚合酶鏈反應(yīng)（Nested-PCR）方法擴(kuò)增env外膜蛋白基因C2-C3(HBX2:6972-7365)

15、區(qū)，PCR產(chǎn)物回收測序，基因序列用Geen tool翻譯為氨基酸序列進(jìn)行比對、軟件分析。聯(lián)合流式結(jié)果及病毒嗜性進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1.不同病毒嗜性CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群第二受體表達(dá)情況
　　通過對HIV/AIDS患者及健康對照的FACS結(jié)果進(jìn)行分析：AIDS病期CD4+、CD8+T細(xì)胞趨化因子受體CCR5、CXCR4的表達(dá)均顯著高于健康對照。不同病毒嗜性HIV/AIDS患者與健康對照進(jìn)行分析，其結(jié)果顯

16、示：CD4+、CD8+T細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)在R5組、X4組均無顯著差異，且顯著高于健康對照組。CD4+T細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)在R5組、X4組、健康對照組無顯著差異。CD8+T細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)在R5、健康對照組中無顯著差異。
　　2.HIV/AIDS患者CD4、CD8+T淋巴細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平與對應(yīng)T細(xì)胞、病毒載量的相關(guān)性
　　結(jié)果顯示：CD4+T細(xì)胞表面CCR5輔助受體的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著負(fù)相

17、關(guān),與病毒載量無顯著相關(guān)性。結(jié)果表明：CD4+T細(xì)胞表面CCR5輔助受體的表達(dá)與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，其表達(dá)水平的變化與CD4+T細(xì)胞的數(shù)量變化關(guān)系密切。
　　結(jié)論:不同病毒嗜性輔助受體的表達(dá)均有升高且差異不大除了CD8+T細(xì)胞表面CXCR4，CD8+T細(xì)胞表面CXCR4在X4嗜性病毒的表達(dá)顯著高于R5嗜性病毒。無論CD4+T細(xì)胞還是CD8+T細(xì)胞其CCR5升高幅度均高于CXCR4，說明艾滋病期患者高病毒載量與細(xì)胞表面CCR5密度升高