一種類水生雙RNA病毒的分離與文蛤細胞病理變化研究.pdf

1、文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)是江蘇重要的經(jīng)濟貝類，而文蛤的暴發(fā)性死亡嚴重阻礙該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。我們在先前的病理學(xué)及流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大規(guī)模死亡的文蛤體內(nèi)存在一種類病毒粒子，該論文對此病毒粒子的基礎(chǔ)生物學(xué)進行研究，探索此病毒與文蛤大規(guī)模死亡之間的聯(lián)系。 運用透射電鏡對異常死亡文蛤的細胞病理變化及感染的病毒粒子進行了超微結(jié)構(gòu)觀察。超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，患病個體的鰓、消化盲囊、消化道和外套膜中均大量

2、存在一種病毒顆粒，該病毒粒子呈球形，無囊膜，直徑45～55rim，核心與核衣殼間無明顯界限，未發(fā)現(xiàn)病毒包涵體。切片結(jié)果顯示，該病毒存在于細胞間質(zhì)及被破壞的上皮及結(jié)締組織的細胞質(zhì)中。 通過差速離心、酒石酸鉀墊超速離心與氯化銫密度梯度離心結(jié)合等方法對病毒粒子分離純化。比較了蔗糖、酒石酸鉀一甘油與氯化銫三種介質(zhì)密度梯度離心的方法，得出氯化銫密度梯度離心適合該病毒粒子的提純。經(jīng)稱量法得到該病毒粒子在氯化銫中的浮密度為1.554～1.58

3、2g/ml。病毒粒子經(jīng)純化后負染結(jié)果顯示，該病毒粒子呈球形，二十面體對稱，無囊膜，直徑在60～75nm，表面結(jié)構(gòu)粗糙，殼粒結(jié)構(gòu)比較明顯。同時運用原子力掃描電子顯微鏡(AFM)對提純病毒粒子進行觀察，發(fā)現(xiàn)該病毒粒子的殼粒結(jié)構(gòu)比較明顯，具有典型的病毒二十面體對稱結(jié)構(gòu)。 將提純病毒粒子進行(RT)-PCR檢測，利用已報道的水生雙RNA病毒通用引物，以病毒核酸(RNA)的cDNA為模板進行擴增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中一對通用引物編號為PrBl:

4、5’-gCCgACATCgTCAACTCCAC-3’，PrB2:5'-gACAggATCATCTTggCATA-3’可以擴增出文獻所報道的大小為524bp的目的條帶。初步分析認為，該病毒應(yīng)初步定位于水生雙RNA病毒。 另外，通過差速離心與超微過濾相結(jié)合的方法得到純凈的病毒液，設(shè)計該病毒人工感染試驗。試驗分設(shè)五組，分別為(1)病毒低濃度浸??；(2)病毒高濃度浸浴：(3)病毒注射；(4)滅活病毒注射；(5)空白對照組(未做任何處理)