缺血再灌注大鼠模型的病理變化及干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)效果研究.pdf

1、目的:
　　探索SD大鼠腦缺血2小時(shí)/再灌注模型超急性期、急性期及部分恢復(fù)期的病理動(dòng)態(tài)變化,明確不同時(shí)期神經(jīng)細(xì)胞死亡/凋亡、小膠質(zhì)細(xì)胞、血腦屏障、炎癥因子及細(xì)胞間黏附分子變化的特點(diǎn)。探索移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)大鼠中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型大鼠的療效及其可能的作用機(jī)理。
　　方法:
　　1、線栓法建立MACO腦缺血2小時(shí)/再灌注模型,行神經(jīng)功能評(píng)分、體重及TTC染色梗死體積的測(cè)量,評(píng)估模型穩(wěn)定性。
　

2、　2、根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將SD大鼠分成正常對(duì)照組(每組4只)、假手術(shù)組(每組4只)和模型組(每組4只),模型組又分為0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、4天、6天、10天、14天、18天共14個(gè)時(shí)程。對(duì)造模后大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,只有評(píng)估為中度損傷的大鼠才能進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。采用HE染色及電鏡觀察腦組織梗死區(qū)和缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡變化,評(píng)估神經(jīng)細(xì)胞死亡和凋亡的時(shí)間。
　　3、根據(jù)

3、隨機(jī)數(shù)字表將SD大鼠分成正常對(duì)照組(每組12只)、假手術(shù)組(每組12只)和模型組(每組6只),模型組又分為0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、4天、6天、10天、14天、18天共14個(gè)時(shí)程。伊文思藍(lán)染色檢測(cè)來(lái)評(píng)估血腦屏障通透性的變化。Iba-1免疫組化檢驗(yàn)?zāi)X組織梗死區(qū)和缺血半暗帶區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞變化。取大鼠血漿,酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿中炎癥因子TNFα、IL-1β和ICAM-1的表達(dá)。
　

4、　4、分離培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增BMSCs(直接貼壁法);流式細(xì)胞儀鑒定BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD106、CD34、CD45、CD11b;腺病毒-增強(qiáng)綠色熒光蛋白(Ad-EGFP)標(biāo)記示蹤BMSCs,并明確其MOI值;
　　5、經(jīng)尾靜脈移植3×106 BMSCs治療MCAO建模后第12小時(shí)、4天、10天的大鼠;建模前后及處死前分別采用改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分(mNSS)、粘附實(shí)驗(yàn)和體重評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能和體能恢復(fù)情況;建模后

5、第7天處死大鼠,取腦組織做酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠腦組織IL-1β、IL-10、BDNF及VEGF表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、線栓法阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈血流,造成其供血區(qū)域的腦梗死并產(chǎn)生神經(jīng)功能障礙。正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均為0分,模型組大鼠再灌注后神經(jīng)功能術(shù)后平均為7.6±0.93分。術(shù)前體重平均為273±18.8g,術(shù)后體重平均為244±50.2g;模型組腦梗死體積百分比為31.40±3.36％。模型復(fù)制成功

6、,操作簡(jiǎn)單,穩(wěn)定性及重復(fù)性好。
　　2、HE染色示神經(jīng)細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)變化出現(xiàn)在腦缺血再灌注后12小時(shí), MCAO術(shù)后24小時(shí)出現(xiàn)壞死區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞的崩解,細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。
　　3、MCAO術(shù)后4小時(shí)組電鏡可見到早期凋亡的過(guò)程變化(細(xì)胞變小、染色質(zhì)凝集)。凋亡的中期特征性變化可在24小時(shí)至4天組出現(xiàn)。晚期凋亡出現(xiàn)在MCAO術(shù)后6天組。
　　4、與假手術(shù)組及正常對(duì)照組比較,MCAO術(shù)后2小時(shí)組TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加

7、(P<0.05),最高值峰出現(xiàn)在MCAO術(shù)后4天組。MCAO術(shù)后6天組與假手術(shù)組及正常對(duì)照組相比,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)明顯增加(P>0.05)。
　　5、與假手術(shù)組及正常對(duì)照組相比,Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞于MCAO術(shù)后12小時(shí)組明顯增加(P<0.05),其峰值出現(xiàn)在MCAO術(shù)后10天組。MCAO術(shù)后18天組與假手術(shù)組及正常對(duì)照組相比,Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)仍有明顯增加(P<0.001)。
　　6、與假手術(shù)組及正常對(duì)照組相比,MC

8、AO術(shù)后2小時(shí)組伊文思藍(lán)含量明顯增加(P<0.05),其峰值出現(xiàn)MCAO術(shù)后24小時(shí)組。至MCAO術(shù)后18天組與假手術(shù)組及正常對(duì)照組相比,伊文思藍(lán)含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　7、MCAO術(shù)后2小時(shí)組與假手術(shù)組及正常對(duì)照組相比,ICAM-1的濃度有明顯增加(P<0.01),其峰值濃度出現(xiàn)在MCAO術(shù)后24小時(shí)組。MCAO術(shù)后18天組ICAM-1濃度與手術(shù)組及正常對(duì)照組相比,無(wú)明顯變化(P>0.05)。另外,本研究發(fā)現(xiàn)MCA

9、O術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)ICAM-1的濃度變化與腦組織伊文思藍(lán)含量的變化相一致。MCAO術(shù)后半小時(shí)組TNF-α濃度與假手術(shù)組及正常對(duì)照組相比,有明顯增加(P<0.05),其峰值濃度分別出現(xiàn)在MCAO術(shù)后4小時(shí)組及10天組。MCAO術(shù)后1小時(shí)組IL-1β濃度與假手術(shù)組及正常對(duì)照組相比,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。IL-1β的峰值濃度分別出現(xiàn)在MCAO術(shù)后6小時(shí)組及10天組。
　　8、BMSCs高表達(dá)CD29(90.8%)、CD90(9

10、2.0%),中表達(dá)CD106(62.5%),低表達(dá)CD11b(21.9%)、CD34(0.7%)、CD45(13.3%)。加入MOI為100的Ad-EGFP孵育24h后BMSCs標(biāo)記率達(dá)80.2±4.9%。8、與PBS組相比,BMSCs移植4天組神經(jīng)功能評(píng)分有明顯改善(P<0.05),體重恢復(fù)也有明顯差異(P<0.05)。BMSCs移植12小時(shí)、4天和10天組IL-1β濃度逐漸下降(P<0.05)。BMSCs移植12小時(shí)、4天和10天組

11、IL-10濃度逐漸增加(P<0.05)。BMSCs移植12小時(shí)、4天和10天組VEGF和BDNF濃度無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　大鼠腦缺血再灌注后4小時(shí)內(nèi),可定義為超早期。大鼠腦缺血再灌注后6小時(shí)至24小時(shí),可定義為急性期。大鼠腦缺血再灌注后24小時(shí)至48小時(shí),可定義壞死期。大鼠腦缺血再灌注后4天至10天,可定義軟化期。大鼠腦缺血再灌注后10天以后,可定義為恢復(fù)期。TNF-α和IL-1β在大鼠腦缺血模型超急

12、性期、急性期和恢復(fù)期起作用,TNF-α可能是炎癥的主要發(fā)起者。TNF-α后再出現(xiàn)IL-1β的表達(dá)增加,提示IL-1β可能是一個(gè)重要的促炎細(xì)胞因子,促進(jìn)了炎癥的擴(kuò)展。研究顯示ICAM-1在大鼠缺血再灌注模型超急性期、急性期、壞死期、軟化期和恢復(fù)期起了作用。ICAM-1的表達(dá)與血腦屏障功能破環(huán)呈時(shí)間正相關(guān)性,ICAM-1也許在血腦屏障破壞中發(fā)揮作用。小膠質(zhì)細(xì)胞在大鼠缺血再灌注模型超急性期、急性期、壞死期、軟化期和恢復(fù)期起了作用。小膠質(zhì)細(xì)胞可

13、能在腦組織神經(jīng)細(xì)胞的損傷和修復(fù)中發(fā)揮了雙重作用。TNF-α可能是IL-1β和ICAM-1表達(dá)上游的誘導(dǎo)因子。本實(shí)驗(yàn)揭示神經(jīng)細(xì)胞死亡出現(xiàn)在腦缺血再灌注后12小時(shí)至24小時(shí),而神經(jīng)細(xì)胞凋亡的峰值出現(xiàn)在腦缺血灌注后4天。BMSCs移植后出現(xiàn)IL-1β濃度逐漸下降,而IL-10濃度逐漸上升的變化。這些數(shù)據(jù)表明,BMSCs移植后可能通過(guò)IL-10來(lái)抑制炎癥因子如IL-1β等表達(dá)來(lái)起到神經(jīng)保護(hù)作用,而非通過(guò)增加VEGF和BDNF來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。