大鼠腦挫傷后低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)與挫傷經(jīng)過時(shí)間的推斷.pdf

1、目的：應(yīng)用免疫組化SABC法、免疫印跡Western Bloting法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠腦挫傷后HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA的時(shí)序性表達(dá)規(guī)律，探討HIF-1α推斷腦挫傷的可行性，旨在為法醫(yī)實(shí)踐中推斷腦挫傷經(jīng)過時(shí)間提供依據(jù)。
　　 方法：選取健康成年SD大鼠64只，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只。參照Feeney法建立大鼠閉合性腦挫傷模型，實(shí)驗(yàn)組按損傷時(shí)間不同分為傷后1h、6h、12h、48h、72

2、h、7d、14d共7組，對(duì)照組動(dòng)物僅切開頭皮，右頂開骨窗，不致腦損傷，在損傷后依規(guī)定時(shí)間內(nèi)處死動(dòng)物，對(duì)照組動(dòng)物于鉆孔后1h處死，取出腦組織，以腦挫傷灶為中心旁開1mm行大鼠腦冠狀切面取材，置于4％多聚甲醛PBS液中固定，用于免疫組織化學(xué)染色；于腦挫傷灶取腦組織-80℃液氮保存用于蛋白和總RNA的提取。應(yīng)用免疫組化SABC法和免疫印跡Western Bloting法檢測(cè)各組HIF-1α蛋白的表達(dá)，利用圖像分析技術(shù)定量測(cè)定免疫組化染色切片的

3、陽性細(xì)胞數(shù)及以條帶積分光密度值，所得數(shù)據(jù)用用SPSS13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將提取的腦組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈的相對(duì)表達(dá)量，所得數(shù)據(jù)用用SPSS13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：(1)HE結(jié)果：對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，核染色較淡、圓形，核仁清楚。損傷組可見腦實(shí)質(zhì)散在出血，蛛網(wǎng)膜下腔、側(cè)腦室出血。所選切

4、面各部位均可見程度不一的神經(jīng)元細(xì)胞核深染、固縮，神經(jīng)元細(xì)胞水腫，周圍出現(xiàn)空隙，逐漸發(fā)展為胞核破碎溶解，神經(jīng)元壞死消失，周圍膠質(zhì)細(xì)胞增生；(2)免疫組織組化學(xué)SABC法染色結(jié)果：對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞偶見HIF-1α表達(dá)，陽性產(chǎn)物呈棕黃色，主要位于神經(jīng)細(xì)胞胞核及胞漿內(nèi)；傷后1h挫傷灶周圍即可觀察到陽性反應(yīng)細(xì)胞，呈散在少量分布；傷后12h可見表達(dá)HIF-1α的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)增多，表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，差異有顯著性(P＜0.05)；48h后達(dá)高峰，陽性細(xì)胞聚集成

5、簇，周圍可見大量棕黃色產(chǎn)物。隨后陽性反應(yīng)細(xì)胞逐漸減少，7d后仍見少量表達(dá)，14d后基本恢復(fù)正常；(3)免疫印跡Western Bloting結(jié)果：腦挫傷后1h即可見條帶，12h時(shí)條帶明顯增寬，48h的條帶最寬，隨后開始減少，到14d時(shí)條帶幾乎不可見。除14d組外，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較，除12h組和72h組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)外，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；

6、(4)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：HIF-1αmRNA于腦挫傷后1h表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，達(dá)到高峰，為正常組的75.58倍，隨后逐漸下降，至48h時(shí)又出現(xiàn)一次高峰，隨后又開始下降，14d時(shí)降至正常水平。
　　 結(jié)論：大鼠腦挫傷后腦組織中HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA的表達(dá)隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)都呈時(shí)序性規(guī)律變化，但變化規(guī)律有所不同，HIF-1αmRNA的表達(dá)高峰出現(xiàn)較早，可用于較早損傷時(shí)間的推斷，兩者綜合分析，