大鼠腦挫傷后PSD-95表達(dá)變化的時(shí)間規(guī)律性研究.pdf

1、腦是人體的生命中樞器官，也是暴力損傷中極易受累的器官，因而腦挫傷是法醫(yī)學(xué)鑒定工作中常見的損傷類型。腦挫傷形成機(jī)制、腦挫傷時(shí)間推斷、腦挫傷程度判斷一直受法醫(yī)學(xué)工作者重視。由于國民經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，建筑業(yè)和交通運(yùn)輸業(yè)的興起，創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生率在近幾年逐年增高，居創(chuàng)傷首位，是青壯年人群首要死亡原因。目前，關(guān)于腦挫傷轉(zhuǎn)歸機(jī)制尚不完全清楚，有許多理論學(xué)說，包括鈣離子超載、微循環(huán)障礙等學(xué)說，然而依據(jù)相應(yīng)的理論學(xué)說研究出的治療方法鮮有可通過Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)

2、，應(yīng)用于臨床治療。腦挫傷是法醫(yī)學(xué)工作中常見的損傷類型，推斷腦挫傷時(shí)間對刑事案件的偵查及審判具有重要意義，然而準(zhǔn)確推斷腦挫傷時(shí)間一直是法醫(yī)學(xué)中的難題，至今尚未圓滿解決因此，有必要進(jìn)一步研究腦挫傷的分子機(jī)理及找出相應(yīng)的指標(biāo)，為臨床診治和法醫(yī)鑒定提供理論依據(jù)。 材料與方法: 一、動物模型的制作，分組與對照 成年雄性SD大鼠50只，體重200-250g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供。隨機(jī)分為9組，每組5只，其中8組為實(shí)驗(yàn)

3、組，1組為對照組，其余實(shí)驗(yàn)組采用吳旭等研制的大鼠腦挫傷模型制作方法，制造大鼠腦挫傷模型。大鼠稱重后，乙醚吸入預(yù)麻醉，2％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切開大鼠頂部頭皮，在人字縫前3mm，矢狀縫旁3mm處鉆直徑為5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完好。采用自由落體打擊裝置，以30g重錘從25cm高處落下，打擊暴露的腦組織。術(shù)后動物分籠飼養(yǎng)，保持墊料清潔及空氣通暢。于傷后3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d和10d將大鼠麻醉

4、后脫頸椎處死，手術(shù)取出腦組織，沿冠狀方向?qū)⒋靷麉^(qū)平均分為兩部分，一部分用于免疫組化染色，另一部分用于Western blot檢測。 二、免疫組織化學(xué)染色 腦組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5μm厚度切片。采用鏈霉素—生物素法(SP法)進(jìn)行免疫組化染色，并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，具體步驟同試劑盒說明書。PSD—95抗體1：400稀釋，4℃孵育過夜。染色過程中另以PBS替代一抗，作為陰性對

5、照。同時(shí)進(jìn)行常規(guī)HE染色。山羊抗大鼠PSD—95多克隆抗體購自北京博奧森公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 三、Western blot檢測 提取腦組織蛋白并進(jìn)行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印，5％脫脂牛奶封閉，一抗(1：200稀釋)、二抗(1：2500稀釋)孵育后，ECL顯色。實(shí)驗(yàn)中以GAPDH為內(nèi)參。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 對照組神經(jīng)細(xì)胞胞

6、漿中可見少量PSD—95陽性染色。實(shí)驗(yàn)組中，腦挫傷后3h，挫傷周邊區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)增多；傷后6h，陽性細(xì)胞數(shù)繼續(xù)升高；傷后12h組陽性細(xì)胞數(shù)與傷后6h組相似；傷后1d，PSD—95陽性細(xì)胞數(shù)下降；傷后3d，PSD—95陽性細(xì)胞數(shù)降至正常水平；傷后5d，陽性細(xì)胞數(shù)再次達(dá)到高峰；傷后7d，SD—95陽性細(xì)胞數(shù)開始減少；傷后10d，陽性細(xì)胞繼續(xù)減少。 二、Western blot結(jié)果 對照組僅見少量PSD—95的表達(dá)；挫

7、傷后3h—6h，出現(xiàn)PSD—95表達(dá)緩慢升高，12h達(dá)高峰，1d后下降，3d降至約正常水平，5d時(shí)又再次升高并達(dá)到高峰，以后逐漸下降。應(yīng)用Fluorchem V2.0 Stand Alone軟件獲取感光條帶的平均光密度值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠腦挫傷模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western blot方法檢測大鼠腦挫傷后PSD—95表達(dá)情況，結(jié)果表明： 1