抗病毒抗生素VS產(chǎn)生菌的改良、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、本文針對(duì)抗生素VS產(chǎn)生菌Streptomyces SN03進(jìn)行高產(chǎn)菌株的選育工作，以高產(chǎn)菌株的發(fā)酵液為試材，研究了發(fā)酵液的性質(zhì)，探索了活性組分的分離工藝，獲得抗生素純品，并研究了抗生素VS對(duì)植物病毒病的防效。結(jié)果如下： 1．采用自然選育結(jié)合誘變育種的紫外線誘變和微波誘變的方法，對(duì)抗生素VS產(chǎn)生菌Streptomyces SN03進(jìn)行了改良。在紫外線照射120s后，分離獲得優(yōu)勢菌株StreptomycesSN03-2-UV-1，抑

2、菌圈直徑達(dá)到29.8mm。以．Streptomycesr SN03-2-UV-1作為微波誘變的出發(fā)菌株；微波處理時(shí)間為50s時(shí)，獲得高效穩(wěn)定菌株．Streptomyces SN03-2-UV-1-W3，大大提高了原始菌株．Streptomyces SN03發(fā)酵液的活性，使抑菌圈直徑由原來的25.5mm增大至33.2mm，活性最大提高率高達(dá)30.20％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出單獨(dú)使用紫外線或微波誘變時(shí)的活性最大提高率，菌株傳代10代后，仍能保持很高的抑

3、菌活性，具有很穩(wěn)定的遺傳性狀。 2．對(duì)抗生素VS發(fā)酵液進(jìn)行初步研究，表明發(fā)酵液對(duì)酸、堿、熱、光均具有良好的穩(wěn)定性，高劑量紫外線照射對(duì)活性有影響，但在實(shí)際應(yīng)用時(shí)自然光中的紫外線強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到試驗(yàn)中的紫外線劑量，所以在應(yīng)用中紫外線的影響可以忽略。pH紙層析試驗(yàn)表明，發(fā)酵液在酸性條件下，能夠出現(xiàn)2個(gè)或3個(gè)抑菌圈，在堿性條件下Rf值又逐漸上升，說明抗生素VS為多組分化學(xué)物，其活性組分在酸性條件下能被分離開，與標(biāo)準(zhǔn)紙層析圖譜比對(duì)，判斷抗生

4、素VS的組分或組分之一為堿性：捷克Doskochilova的八種溶劑系統(tǒng)紙層析試驗(yàn)表明活性組分為極性物質(zhì)，溶于水。 3．對(duì)抗生素VS的分離提純技術(shù)進(jìn)行比較，最終確定其提純工藝為：發(fā)酵液離心過濾，獲得的上清液用草酸調(diào)酸至pH2～pH3，在50℃～60℃水浴中保溫2h，過濾后減壓濃縮：濃縮液上樣于Diaion HP20大孔吸附樹脂，用25％～75％乙醇以0.25mL/min的速度梯度洗脫，分管收集洗脫液，進(jìn)行活性測定，對(duì)活性組分分別

5、進(jìn)行紫外掃描，收集活性組分，減壓濃縮；濃縮液點(diǎn)樣于硅膠GF254薄板上，在甲醇：水(4：1)的展層劑中上行展層，收集活性帶，用無離子水浸提24h，過濾，上清液冷凍干燥，再用少量無離子溶解；溶解后上樣于Sephadex LH-20凝膠柱，用25％～70％的甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，分管收集洗脫液，進(jìn)行活性測定，分別對(duì)活性組分進(jìn)行紫外掃描，收集峰形一致的組分：冷凍干燥脫去水份，得到白色粉末狀抗生素VS純品。 4．研究抗生素VS的理化性質(zhì)

6、?？股豓S的純品為白色粉末狀，易溶于水，微溶于甲醇，不溶于乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、正己烷、苯、氯仿、四氯化碳、吡啶等有機(jī)溶劑?？股豓S純品有很強(qiáng)的耐冷、耐熱性。高劑量紫外線對(duì)活性略有影響。 官能團(tuán)反應(yīng)試驗(yàn)表明抗生素VS的結(jié)構(gòu)中可能含有糖或糖苷鍵，可能為氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，不含有還原糖、不飽和烯基、醛基、酚基等基團(tuán)。 5．通過對(duì)抗生素VS的紫外光譜掃描，活性組分水溶液在209nm處有一吸收峰，在0.1 mo

7、l/L HCl溶液中208rlm處有一吸收峰，二者的最大吸收波長相近，但是峰形有差別，而在0.1mol/L的NaOH溶液中吸收峰后移至224nm。推斷抗生素VS中含有芳香環(huán)。對(duì)活性組分進(jìn)行核磁測定，用D<,2>O進(jìn)行交換，脈沖序列壓制水峰，測定2D NOESY，結(jié)果在8.5～8.0ppm處有信號(hào)峰，說明提取物中含有酰銨鍵，為蛋白或多肽；在4.5～3.0ppm之間有較強(qiáng)信號(hào)峰，表明提取物中含有糖；在其他位置處的信號(hào)峰顯示提取物中含無機(jī)組分

8、。核磁共振的結(jié)果與官能團(tuán)試驗(yàn)的結(jié)果一致。經(jīng)過分析，該樣品為多肽或小蛋白質(zhì)分子，暫命名為抗病毒抗生素VS，但確切結(jié)構(gòu)尚需進(jìn)一步研究。 6．研究了抗生素VS對(duì)植物病毒病的防治作用。結(jié)果表明，抗生素VS對(duì)TMV、CMV、PVY等植物上常見的病毒均有很好的防治效果。研究抗生素VS對(duì)心葉煙上TMV的影響，調(diào)查枯斑抑制率，最高可達(dá)96.72％；在普通煙上，抗生素VS對(duì)TMV的防治效果可高達(dá)61.64％。在黃瓜和煙草上，抗生素VS對(duì)CMV的防