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文檔簡介
1、異基因造血干細胞移植(Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation,allo-HSCT)是血液系統(tǒng)惡性疾病、部分免疫缺陷性疾病、遺傳性疾病、代謝性疾病、及部分實體瘤的重要治療手段,但是移植后疾病復發(fā)是導致移植病患死亡的首要原因。盡管過去30年allo-HSCT治療技術已取得令人矚目的進步,但對如何減少allo-HSCT后疾病復發(fā)及提高復發(fā)患者生存率仍進展甚微,原因在于allo-HS
2、CT后白血病復發(fā)的確切分子機制迄今不明。本研究從白血病自身生物學特性與機體抗白血病免疫的內外調控機制,圍繞急性白血病allo-HSCT后復發(fā)機制開展研究。
第1章異基因造血干細胞移植后供者細胞來源的白血病復發(fā)機制研究
Allo-HSCT后白血病復發(fā)分為兩大類,一類復發(fā)的白血病細胞來源于正常的供者細胞,稱為供者細胞白血?。―onor Cell Leukemia, DCL),DCL是移植后較為少見的復發(fā)形式,發(fā)生率為0.
3、13%-5%,DCL確切機制仍不明確,正常供者造血干/祖細胞的癌基因轉化被認為是DCL發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié),通過DCL研究正常的供者干細胞如何在患者體內轉變?yōu)閻盒园籽〖毎嗍茄芯堪籽“l(fā)病機制的獨特生物學模型。
本研究設想在DCL病理過程中存在腫瘤“二次打擊”模型,通過對臨床發(fā)生移植后DCL患者的一系列動態(tài)標本,包括患者白血病初診骨髓標本、化療后完全緩解骨髓標本、移植前持續(xù)緩解期骨髓標本、移植后第1個月、第9個月、第12個月骨髓
4、標本、移植后發(fā)生DCL時骨髓標本和患者口腔粘膜標本,以及其健康供者骨髓、外周血和口腔粘膜標本,檢測是否動態(tài)發(fā)生目前已明確的、在白血病發(fā)生機制中起關鍵作用的兩種類型基因突變:Ⅰ類突變包括FMS樣酪氨酸激酶3基因(Fms-related Tyrosine Kinase3 Gene, FLT3),成神經細胞瘤RAS病毒致癌基因(Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog Gene, NRAS),Ⅱ類突變包
5、括轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白α基因(CCAAT Enhancer-binding Protein Gene,CEBPA),髓系-淋系或混合系白血病基因(Myeloid-lymphoid or Mixed-lineageLeukemia Gene, MLL),核磷蛋白基因(Nucleophosmin Gene, NPM1)。結果發(fā)現,健康供者的造血干細胞帶有CEBPA基因家族性突變(584_589dup)(“一次打擊”),但未引起白
6、血病;敏感的供者干細胞在特殊的患者體內環(huán)境中獲得了CEBPA基因的另外2個位點突變(247dupC和914_916dup)(“二次打擊”),最終惡性克隆轉化成白血病細胞。本研究首次證實在移植后供者細胞來源的白血病復發(fā)中存在供者正常干/祖細胞動態(tài)獲得關鍵功能基因—CEBPA基因多點突變,從而發(fā)生惡性克隆轉化為白血病細胞,首次揭示allo-HSCT后供者細胞來源的白血病復發(fā)中存在多重基因突變打擊機制,前期研究結果已以第一作者發(fā)表在血液學專業(yè)
7、頂級期刊Blood雜志(IF9.898)。
第2章CEBPA基因多點突變致急性白血病發(fā)生的分子機制研究
為進一步明確CEBPA基因多點突變致急性白血病發(fā)生的分子機制,在本部分研究中,我們對第一部分研究中發(fā)現的CEBPA基因3個位點的突變:N'端家族性突變(584_589dup,影響蛋白TAD2功能區(qū))、N'端移碼突變(247dupC,導致正常42KDa全長蛋白翻譯提前終止,過度合成缺乏TAD1功能區(qū)的截短30KDa蛋
8、白異構體)、和C'端突變(914_916dup,影響蛋白bZIP功能區(qū)),利用慢病毒質粒載體(pLenti6.3/V5-DEST)構建3種突變及CEBPA基因野生型的慢病毒質粒。將CEBPA基因野生型和各個突變體轉染4種急性髓系白血病細胞株(K562,NB4,Kasum-1, HL60),小鼠正常髓母細胞株(32Dc13),觀察CEBPA基因不同類型突變對C/EBPα蛋白的抗白血病作用、細胞周期阻滯和促進粒系分化等三大重要功能的影響。結
9、果發(fā)現:CEBPA基因N'端移碼突變(247dupC)產生的截短的C/EBPα-30KDa蛋白具有Ⅰ類突變的作用,使細胞凋亡障礙,賦予細胞無限增殖的能力。影響TAD2功能區(qū)的CEBPA基因N'端家族性突變(584_589dup)影響C/EBPα蛋白的周期阻滯功能。CEBPA基因C'端突變對C/EBPα蛋白抑制增殖、誘導凋亡和促進分化的功能均有損害,可能同時具有Ⅰ類和Ⅱ類突變的作用。我們的結果提示CEBPA基因不同位點突變在白血病發(fā)生的病
10、理過程中,分別發(fā)揮Ⅰ類突變和Ⅱ類突變的作用。
第3章異基因造血干細胞移植后患者自身細胞來源的白血病復發(fā)的基因分子機制研究
基于90%以上allo-HSCT后復發(fā)的白血病細胞仍來源于患者自身細胞,雖然對這類復發(fā)普遍認為是患者殘留放/化療耐藥白血病細胞克隆所致,但是越來越多研究證實白血病化療后復發(fā)時,雖然復發(fā)的惡性細胞克隆與初發(fā)克隆具有某些相同的、來自更早期的前體細胞克隆起源,但是從初發(fā)到復發(fā)過程中產生了不同的基因突變,
11、絕大部分復發(fā)克隆是由正常前體細胞或初發(fā)白血病細胞進一步獲得新的基因突變后演變而來,少部分復發(fā)克隆則與初發(fā)克隆具有完全不同的基因背景,從初發(fā)到復發(fā)過程中白血病細胞克隆發(fā)生了克隆演變。
因此我們設想在allo-HSCT后患者自身細胞來源的白血病復發(fā)中除了體內殘留耐藥白血病細胞克隆外,復發(fā)克隆亦可能是由初發(fā)白血病細胞或患者正常細胞獲得新的基因突變成為優(yōu)勢克隆演變而來。在本部分研究中,我們?yōu)榘l(fā)現與成人急性淋巴細胞白血?。ˋcute L
12、ymphoblastic Leukemia, ALL)移植后復發(fā)相關的基因突變和明確在成人ALL從初診到移植后復發(fā)過程中是否存在白血病細胞克隆演變,選擇臨床最常見ALL類型—ph-、正常核型的前體B細胞型ALL,首次利用全基因組外顯子測序技術,在全基因組范圍內對患者初診白血病細胞、移植前處于化療后完全緩解期的血液細胞和allo-HSCT后發(fā)生復發(fā)時的白血病細胞進行基因背景比對分析,發(fā)現ALL從初診到allo-HSCT后復發(fā)過程中存在3種
13、白血病細胞克隆演變模式,第一種模式中,患者移植后復發(fā)的白血病細胞與初發(fā)白血病細胞具有完全相同的基因背景,復發(fā)克隆來自原發(fā)克隆,是原發(fā)克隆的再活化。第二種模式中,患者移植后復發(fā)的白血病細胞與初發(fā)白血病細胞具有某些相同的基因背景,可能起源于初發(fā)克隆中少數克隆或亞克隆,進一步獲得新的基因突變而成為優(yōu)勢克隆。第三種模式中,患者移植后復發(fā)的白血病細胞與初發(fā)白血病細胞具有完全不同的基因背景,可能是由正常干/祖細胞獲得特異性基因突變后產生的新的、惡性
14、克隆。
我們進一步將通過全基因組外顯子測序獲得的、可能與ALL移植后復發(fā)相關的25個基因突變位點所涉及的23個基因,在驗證組患者標本中進行驗證,并結合生物信息學、基因功能分析,篩選出與Ph-、正常核型前體B細胞型ALL發(fā)生allo-HSCT后復發(fā)相關的PTPN21基因突變。
第4章異基因造血干細胞移植后白血病復發(fā)的免疫逃逸機制研究
異基因造血干細胞移植不同于化療的獨特機制在于移植后的GVL效應,通過異體細胞
15、免疫反應清除殘留白血病細胞,是最終治愈白血病的關鍵,但是,最終導致復發(fā)的白血病細胞是如何逃逸GVL效應,其免疫逃逸機制目前仍不明確。在本部分研究中,我們?yōu)榘l(fā)現影響移植后GVL效應的關鍵分子,首次基于中國人群遺傳背景,圍繞一系列參與GVL免疫反應各個重要環(huán)節(jié)的分子,在中心接受allo-HSCT的白血病患者及其干細胞供者中開展這些參與GVL反應的重要分子包括:細胞因子—腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-alpha,
16、TNFα)及其受體、干擾素γ(Interferon-γ, IFNγ)、轉化生長因子β(TransformingGrowth Factor-β,TGFβ)及其受體、白介素-10(Interleukin, IL-10);免疫細胞受體—NK細胞表面重要激活型受體NKG2D(Natural Killer Group2, Member D)和T細胞表面最重要的共刺激分子—CD28,可誘導共刺激分子(Inducible Co-stimulator,
17、ICOS)和細胞毒性T淋巴細胞抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte antigen4,CTLA-4);免疫效應分子—粒酶B(Granzyme B)、死亡受體Fas及其配體;天然免疫相關基因—Toll樣受體(TLR1,TLR2,TLR3,TLR8,TLR9)等的基因型與移植后復發(fā)風險的關系研究,在這些眾多的、參與移植后免疫反應各個重要環(huán)節(jié)的分子中發(fā)現干細胞供者CTLA-4和NKG2D的基因型、急性髓系白血病(Acute M
18、yeloid Leukemia,AML)患者的Fas基因型顯著影響移植后白血病復發(fā)風險,首次報道接受干細胞供者為CTLA-4高表達基因型的患者或干細胞供者為NKG2D低表達基因型的患者,及Fas基因-670位點為TT基因型的AML患者,移植后復發(fā)風險明顯增高,結果提示NKG2D、CTLA-4和Fas的表達高低影響allo-HSCT后異體反應性免疫活性細胞對白血病細胞的殺傷敏感性,為闡明白血病移植后復發(fā)的免疫逃逸機制找到關鍵靶點。研究結果
19、已以第一作者發(fā)表在國際造血干細胞移植權威期刊《Haematologica》(IF6.424)、《Bone Marrow Transplantation》(IF3.746)和《Biology of Blood andMarrow Transplantation》(IF3.873)。
結語:
本研究的創(chuàng)新點在于:
(1)在理論上,首次揭示allo-HSCT后供者細胞來源的白血病復發(fā)中存在多重基因突變打擊機制,首
20、次證實供者正常干/祖細胞動態(tài)獲得關鍵功能基因—CEBPA基因多點突變,發(fā)生惡性克隆轉化為白血病細胞。
(2)首次關注CEBPA基因不同類型突變對C/EBPα蛋白的誘導細胞凋亡、細胞周期阻滯和促進粒系分化功能的影響。
(3)對占allo-HSCT后白血病復發(fā)90%以上的患者自身細胞來源的復發(fā),首次提出并證實存在關鍵性基因突變和白血病細胞克隆演變的創(chuàng)新性理論,并篩選出與成人急性淋巴細胞白血病發(fā)生移植后復發(fā)相關的PTPN2
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