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文檔簡介
1、抗生素處理是影響嬰兒腸道菌群定植的重要因素之一。臨床上許多廣譜抗生素作為兒科治療的常用藥物,具有減少腸道菌群多樣性等作用。直接利用嬰兒進(jìn)行腸道菌群研究存在倫理學(xué)限制,利用無菌動物(germ free animal,GF動物)構(gòu)建攜帶嬰兒腸道菌群的人源菌群動物(infant human floral-assocciated animal,IHFA動物)可以為研究抗生素處理對腸道菌群的影響提供了一個有效的模型。IHFA動物模型已有初步的研究
2、和應(yīng)用,但缺乏對嬰兒腸道菌群在無菌動物體內(nèi)的定植規(guī)律的系統(tǒng)研究,因此IHFA動物模型是否適用于抗生素處理對嬰兒腸道菌群的影響未知。此外,由于目前國內(nèi)無菌動物研究和服務(wù)水平較低,限制了IHFA模型的研究和應(yīng)用。因此,本研究擬建立無菌小鼠的自動哺乳技術(shù),為高效獲得無菌小鼠提供條件;利用無菌小鼠建立IHFA小鼠(infant humanfloral-assocciated mice)模型,研究小鼠年齡和品系因素對嬰兒腸道菌群定植的影響;利用I
3、HFA小鼠研究臨床劑量的阿莫西林處理對嬰兒腸道菌群的影響。
方法
1.為高效制備無菌小鼠,建立乳鼠自動哺乳方法。對3日齡C57BL/6J小鼠實施微創(chuàng)胃瘺手術(shù)(n=48),利用蠕動泵將小鼠替代乳(mouse milk substitute,MMS)通過胃瘺泵入小鼠胃內(nèi),利用相同日齡的母乳喂養(yǎng)乳鼠作為正常對照組(n=20),觀測其生長發(fā)育利用DGGE指紋圖譜技術(shù)評估其腸道菌群變化。將自動哺乳方法應(yīng)用到無菌剖腹產(chǎn)獲
4、得的新生無菌昆明乳鼠,觀測其生長發(fā)育及成年小鼠的血液生化指標(biāo)及繁殖能力。
2.為研究嬰兒腸道菌群在無菌小鼠體內(nèi)的定植規(guī)律,將7日齡無菌乳鼠(昆明小鼠n=10;Balb/c小鼠,n=10),接種3月齡健康母乳嬰兒糞便,建立IHFA小鼠模型。利用DGGE指紋圖譜技術(shù)及雙歧桿菌、乳桿菌的特異性引物qRT-PCR檢測postnatal day7(PND7),PND14、PND21的IHFA小鼠腸道菌群,比較品系不同及不同年齡對嬰兒
5、腸道菌群在無菌小鼠體內(nèi)定植的影響。
3.為研究抗生素對嬰兒腸道菌群的影響,將IHFA Balb/c小鼠自PND7至PND21灌胃阿莫西林(100mg/kg,n=10)或等量生理鹽水(n=10)。利用DGGE指紋圖譜技術(shù)及雙歧桿菌、乳桿菌的特異性引物qRT-PCR檢測PND21,PND53 IHFA小鼠腸道菌群,研究幼年阿莫西林對IHFA嬰兒腸道菌群的影響及成年后的恢復(fù)情況。
結(jié)果
1.改進(jìn)了乳鼠
6、的自動哺乳技術(shù),建立了快速制備無菌小鼠的方法。在自動哺乳條件下,無菌小鼠和普通小鼠均可正常生長發(fā)育。48只自動哺乳11天后,37只C57BL/6J小鼠存活。腸道菌群V3-DGGE圖譜顯示,自動哺乳與母乳喂養(yǎng)組條帶總數(shù)、shannon指數(shù)無顯著差異。然而兩組間少數(shù)DGGE條帶有明顯差異。上述結(jié)果提示,雖然對于3日齡C57BL/6J小鼠能成功進(jìn)行胃瘺手術(shù)并自動哺乳存活,但自動哺乳會導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生改變。成功將乳鼠的自動哺乳方法應(yīng)用于無菌乳鼠
7、,自動哺乳21天后,無菌小鼠存活率可達(dá)62.5%,自動哺乳獲得的無菌雌鼠產(chǎn)仔數(shù)量低于母乳喂養(yǎng)獲得的無菌雌鼠(P<0.05)。自動哺乳獲得的無菌小鼠和母乳喂養(yǎng)獲得的無菌小鼠的生化指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。
2.通過比較年齡和品系因素對嬰兒腸道菌群定植的影響,系統(tǒng)研究了嬰兒腸道菌群在無菌小鼠體內(nèi)的定植規(guī)律。Balb/c小鼠腸道菌群與人的相似性指數(shù)(Cs)顯著高于昆明小鼠(P<0.05),兩組DGGE條帶有明顯差異,在聚類
8、分析和PCA圖中兩組能很好的分離。不同年齡的IHFA小鼠的DGGE條帶及與人的相似性指數(shù)(Cs)有明顯差異,在聚類分析和PCA圖中兩組能很好的分離。在PND7、14和21,昆明小鼠和Balb/c小鼠體內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌定植數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。乳桿菌數(shù)量隨小鼠年齡增長而減少,但始終明顯高于人。雙歧桿菌數(shù)量隨小鼠年齡增長而增加,但始終明顯低于人。
3.通過阿莫西林處理組和正常對照組的比較,證明阿莫西林對嬰兒腸道菌群
9、有顯著影響,停止干預(yù)后至53日齡,仍不能完全恢復(fù)。在PND21的DGGE結(jié)果中,阿莫西林處理組與正常對照組shannon指數(shù)及均勻度差異顯著(P<0.05),條帶數(shù)無顯著差異(P>0.05),在聚類分析和PCA圖中兩組能很好的分離;在PND53的DGGE結(jié)果中,阿莫西林處理組與正常對照組shannon指數(shù)及豐富度差異顯著(P<0.05),均勻度無顯著差異(P>0.05),在聚類分析和PCA圖中兩組均不能很好的分離;PND21阿莫西林處理
10、顯著降低腸道菌群中的雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量。在PND53,與正常對照組比較阿莫西林處理組均勻度、乳桿菌數(shù)量及雙歧桿菌數(shù)量均無顯著差異。
結(jié)論
1.通過改進(jìn)乳鼠自動哺乳技術(shù),建立了快速制備無菌小鼠的方法。對SPF及無菌乳鼠進(jìn)行胃瘺手術(shù)和自動哺乳是可行的,乳鼠生長發(fā)育正常,自動哺乳獲得的成年無菌小鼠可正常繁殖獲得子代無菌小鼠,但自動哺乳會導(dǎo)致攜帶正常菌群的乳鼠菌群紊亂。
2.IHFA小鼠能部分模擬嬰兒
11、腸道菌群結(jié)構(gòu),小鼠年齡和品系因素對嬰兒腸道菌群定植有顯著影響。在制備IHFA小鼠模型時,無菌小鼠的年齡和品系因素均可影響嬰兒腸道菌群定植。嬰兒腸道菌群在無菌小鼠體內(nèi)定植可一定程度的模擬嬰兒腸道菌群,但存在的差異不可忽視(如乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量差異)。
3.阿莫西林處理可顯著改變IHFA乳鼠的嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu),且成年后腸道菌群結(jié)構(gòu)未完全恢復(fù)正常。與文獻(xiàn)報道的臨床研究及動物模型研究結(jié)果一致,提示IHFA小鼠是評價抗生素處理對
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