喹賽多對(duì)恒化器模型中人腸道菌群的影響.pdf

1、喹賽多是喹噁啉類(lèi)一種新型的抗菌促生長(zhǎng)劑，能促進(jìn)畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，并能有效降低疾病的感染率，安全低毒高效的特性使其在畜牧業(yè)中有較好的研究及應(yīng)用前景。雖然實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)喹賽多的代謝及殘留消除規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究，毒理學(xué)方面的研究顯示為一類(lèi)安全性較高的藥物，而目前還未從微生物學(xué)安全性的角度進(jìn)行分析，因此為了保證食品安全，有必要考察喹賽多殘留是否對(duì)人的腸道菌群有負(fù)面效應(yīng)，對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)、代謝活性、耐藥率及定植屏障功能的發(fā)揮是否有

2、干擾，同時(shí)抗菌藥微生物影響作用又是食品安全評(píng)估中要求進(jìn)行的一項(xiàng)重要內(nèi)容，因此本試驗(yàn)應(yīng)用離體恒化器模型，系統(tǒng)評(píng)價(jià)不同劑量喹賽多對(duì)人腸道微生物菌群的作用，豐富其微生物學(xué)安全性方面的資料，為喹賽多申報(bào)和進(jìn)一步推廣使用提供全面科學(xué)的資料。
　　 1、喹賽多對(duì)腸道菌群的影響
　　 本研究采用FDA推薦使用的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)研究喹賽多對(duì)人結(jié)腸菌群的影響。首先進(jìn)行喹賽多及其主要代謝物對(duì)腸道菌株(大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、脆弱擬桿菌)的藥

3、敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)喹賽多主要代謝物Cy1、Cy2、Cy4、Cy6、Cy10、Cy12與原形喹賽多相比均沒(méi)有抗菌活性，因此模型系統(tǒng)中僅考慮喹賽多對(duì)結(jié)腸菌群的微生物學(xué)效應(yīng)。根據(jù)喹賽多對(duì)臨床分離的四種優(yōu)勢(shì)菌的藥敏的范圍是1-16μg/mL，設(shè)計(jì)了包含此范圍的一系列不同濃度0.5-128μg/mL在厭氧箱中與糞樣孵育，通過(guò)對(duì)四種優(yōu)勢(shì)菌數(shù)量及兼性需氧厭氧菌(大腸桿菌、腸球菌)耐藥率考察，最終確定終濃度為4μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、12

4、8μg/mL在模型中進(jìn)行預(yù)試。
　　 模型接種糞樣后第7d達(dá)到平衡，于第13d添加終濃度為4μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、128μg/mL的喹賽多，考察不同濃度作用下對(duì)四種優(yōu)勢(shì)菌(大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、脆弱擬桿菌)數(shù)量影響、短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)影響及兼性需氧厭氧菌耐藥率變化(大腸桿菌、腸球菌)，連續(xù)給藥7天，第21d接種108CFU/mL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌1mL，接種三天，通過(guò)采樣計(jì)數(shù)沙門(mén)氏菌的數(shù)量來(lái)

5、判斷腸道菌群的定植屏障功能是否破壞。
　　 在4μg/mL、16μg/mL劑量下發(fā)現(xiàn)對(duì)腸道代表菌株的數(shù)量、短鏈脂肪酸、兼性需氧厭氧菌耐藥率及沙門(mén)氏菌數(shù)量均在95%置信范圍內(nèi)，也就是說(shuō)，這兩個(gè)劑量組對(duì)腸道菌群沒(méi)有影響。加藥期間這兩個(gè)劑量組下大腸桿菌數(shù)量保持在106CFU/mL濃度，腸球菌濃度104CFU/mL，雙歧桿菌、脆弱擬桿菌濃度107CFU/mL，均在95%置信范圍內(nèi)，也均在正常生理值范圍內(nèi)；對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的數(shù)量計(jì)數(shù)分析，

6、也發(fā)現(xiàn)4μg/mL、16μg/mL劑量下沙門(mén)氏菌數(shù)量與對(duì)照組相比沒(méi)有差異，在模型內(nèi)沒(méi)有增值的趨勢(shì)。
　　 相反地，32μg/mL、128μg/mL這兩個(gè)劑量組對(duì)四種觀測(cè)指標(biāo)則有不同程度的影響。加藥期間對(duì)四種代表菌株數(shù)量均有影響，厭氧菌(雙歧桿菌、脆弱擬桿菌)數(shù)量降低程度更明顯；大腸桿菌、腸球菌耐藥率增加；沙門(mén)氏菌數(shù)量與對(duì)照組相比有差異，在模型中有增值的趨勢(shì)，腸道菌群的定植抗力作用受到破壞；但是32μg/mL、128μg/mL劑量

7、組并沒(méi)有影響短鏈脂肪酸的濃度，加藥期間乙酸、丙酸、丁酸的濃度均在95%置信范圍內(nèi)，可能與模型系統(tǒng)不能模擬腸道吸收功能有關(guān)，使短鏈脂肪酸濃度變化不是很明顯。在恒化器模型中通過(guò)對(duì)4μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、128μg/mL劑量的考察結(jié)果顯示，16μg/mL劑量組對(duì)考察的指標(biāo)沒(méi)有影響，不會(huì)擾亂人腸道菌群的平衡。
　　 2、大腸桿菌及腸球菌耐藥方式分析
　　 模型加藥前期(第8-13d)及加藥期(第14-20d

8、)從模型中采取樣品分離耐藥大腸桿菌和腸球菌，加藥前期32μg/mL模型中分離大腸桿菌和腸球菌各10株；128μg/mL劑量組大腸桿菌和腸球菌各分離9株。加藥期間，32μg/mL濃度下耐藥大腸桿菌和腸球菌各14株，128μg/mL劑量組耐藥大腸桿菌和腸球菌各分離13株。首先對(duì)分離的耐藥大腸桿菌、腸球菌進(jìn)行耐藥表型分析，發(fā)現(xiàn)模型加藥前后分離大腸桿菌對(duì)喹噁啉類(lèi)藥物耐藥嚴(yán)重(MIC≥64μg/mL)，此外還對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐(MIC≥128μ

9、g/mL)。設(shè)計(jì)引物對(duì)分離耐藥大腸桿菌和腸球菌進(jìn)行喹噁啉類(lèi)耐藥基因oqxAB擴(kuò)增，檢測(cè)我們臨床的分離的耐藥菌中是否有這種耐藥基因，目的片段oqxA和oqxB的大小分別是670bp和520bp。加藥前期32μg/mL濃度分離的10株大腸桿菌中3株有oqxAB基因，128μg/mL濃度下9株耐藥大腸桿菌中有1株有oqxAB基因；加藥期間32μg/mL濃度模型14株耐藥大腸桿菌有5株有oqxAB基因，128μg/mL劑量組13株耐藥大腸桿菌中

10、有3株檢測(cè)有oqxAB目的條帶，模型加藥前后分離大腸桿菌都是耐藥的，即加藥前模型耐藥大腸桿菌是固有耐藥的，32、128μg/mL劑量組大腸桿菌耐藥率增加是藥物對(duì)固有耐藥大腸桿菌的選擇作用，固有耐藥大腸桿菌過(guò)度生長(zhǎng)繁殖表現(xiàn)耐藥率增加，有研究報(bào)道厭氧條件下喹賽多對(duì)大腸桿菌的MBC≤32μg/mL，因此模型中這兩個(gè)劑量組下不可能誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生。而我們加藥前期及加藥期間分離的耐藥腸球菌卻都沒(méi)有oqxAB基因，可能是別的耐藥基因介導(dǎo)，有待進(jìn)一步

11、研究。而對(duì)攜帶有oqxAB基因的大腸桿菌進(jìn)一步分析耐藥方式，提取質(zhì)粒，并作為擴(kuò)增模板，仍有oqxAB基因目的片段大小正確的條帶，之后又進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，與報(bào)道的oqxA和oqxB基因耐藥質(zhì)粒的同源性分別是99%和100%，因此初步可以確定我們臨床分離的耐藥大腸桿菌oqxAB基因位于質(zhì)粒上，這種耐藥方式有質(zhì)粒介導(dǎo)，這與文獻(xiàn)報(bào)道oqxAB基因在質(zhì)粒上的研究是一致的。
　　 綜上所述，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同濃度喹賽多考察對(duì)模型中人腸道菌群的影響，

12、16μg/mL劑量組對(duì)腸道四種優(yōu)勢(shì)菌數(shù)量、大腸桿菌和腸球菌耐藥率、短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)、定植屏障指標(biāo)沒(méi)有影響；32、128μg/mL劑量組對(duì)腸道菌群指標(biāo)有不同程度的影響，16μg/mL濃度是不會(huì)對(duì)人腸道菌群有影響的，是一類(lèi)較為安全的抗菌促生長(zhǎng)劑。另外，32、128μg/mL劑量組大腸桿菌耐藥率的升高是藥物對(duì)固有耐藥大腸桿菌選擇作用，殺死敏感菌同時(shí)，固有耐藥菌過(guò)度生長(zhǎng)繁殖所致的耐藥率的增加，而耐藥大腸桿菌中可以擴(kuò)增出喹噁啉類(lèi)耐藥