中藥解毒顆粒對晚期肝癌患者腸道菌群的影響.pdf

1、背景:
　　長期以來，中醫(yī)藥一直是治療肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的重要力量。在國內(nèi)，中醫(yī)藥被廣泛應(yīng)用于肝癌預(yù)防和治療的全過程，尤其在晚期肝癌中的應(yīng)用更為常見。多年的中西醫(yī)結(jié)合研究為臨床提供了為數(shù)不少的成藥、驗方，其療效也逐步得到認(rèn)可。2011年中國衛(wèi)生部頒布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》明確將中醫(yī)藥列入晚期肝癌的系統(tǒng)治療，并指出中醫(yī)藥“可以改善癌癥相關(guān)癥狀和生活質(zhì)量，可能延長生存期，可以作為肝

2、癌治療的重要輔助手段”。
　　中藥解毒顆粒是我科開發(fā)的院內(nèi)制劑，在我科的日常肝癌防治中應(yīng)用廣泛，經(jīng)過十幾年的臨床驗證，療效確切。但其作用機(jī)制尚不明確。眾所周知，中藥復(fù)方成分復(fù)雜，需要煎煮后，經(jīng)患者口服，并通過腸道吸收代謝后發(fā)揮療效，這就使其有效成分、及后續(xù)作用機(jī)制的研究變得相當(dāng)復(fù)雜。近年來，腸道菌群與腫瘤相關(guān)聯(lián)的研究備受關(guān)注，腸道也是中藥吸收代謝的必經(jīng)之地，因此，本課題想從腸道菌群的角度去探討口服解毒顆粒所產(chǎn)生的影響。
　　

3、此外，免疫治療是近年來治療晚期肝癌的重要手段之一。其中，免疫檢查點(diǎn)阻斷(Immune checkpoint blockade)是當(dāng)下研究的熱門。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原-4(lymphocyte-associated antigen4，CTLA-4)及程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death protein1，PD-1)是常見的阻斷靶點(diǎn);阻斷CTLA-4及PD-1，可以通過影響T細(xì)胞功能發(fā)揮抗腫瘤作用。有文獻(xiàn)報道，腸

4、道菌群可增強(qiáng)上述靶點(diǎn)的抑制劑的作用。因此，本課題以免疫檢查點(diǎn)阻斷為切入點(diǎn)，探討解毒顆粒對CTLA-4及PD-1的調(diào)節(jié)作用。
　　目的:
　　1、觀察解毒顆粒對晚期肝癌患者腸道菌群的影響。2、研究解毒顆粒對晚期肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞CTLA-4與PD-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　1、選取年齡≥18歲、巴塞羅那臨床肝癌分期為C期(BCLC-C)的HCC患者，隨機(jī)分為解毒顆粒組和對照組，每組各10例。解毒顆粒組

5、每日沖服解毒顆粒，早晚各一次;解毒顆粒組服藥前留取一次糞便，服解毒顆粒后一個月與兩個月各留取一次糞便，共三次。對照組不服用解毒顆粒，共留取三次糞便，每次間隔一個月。解毒顆粒組服藥前留取一次靜脈血，兩個月后再留取一次靜脈血，共兩次。對照組共留取兩次靜脈血，間隔兩個月。
　　2、采用16S多樣性測序分析對收集的糞便標(biāo)本分別進(jìn)行DNA提取、質(zhì)量檢測、測序，通過各菌屬豐度產(chǎn)生的變化，觀察解毒顆粒對腸道菌群所產(chǎn)生的影響，并通過SPSS21.

6、0(IBM Corp)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組細(xì)菌豐度治療前后的變化趨勢使用重復(fù)測量的多因素方差分析(ANOVA of repeated measurement data);菌屬OTU水平的差異分析使用Kruskal-Wallis檢驗法(Kruskal-Wallistest)。
　　3、采用流式細(xì)胞術(shù)探討解毒顆粒對晚期肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞CTLA-4及PD-1表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、解毒顆粒組的患者在

7、服藥前所具有的與腸癌、肝癌發(fā)病相關(guān)的梭菌屬Ⅺ(ClostridiumⅪ)及消化鏈球菌科細(xì)菌（Peptostreptococcaceae）在服用解毒顆粒后一個月與兩個月均消失不見，而在對照組中，上述兩菌治療前后無明顯變化。2、對照組中，可以增強(qiáng)肝癌免疫抑制劑療效的擬桿菌屬細(xì)菌（Bacteroides）的占比隨時間變化呈明顯減少趨勢，在各個時間點(diǎn)擬桿菌屬細(xì)菌的占比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)且時間與分組存在交互作用，時間因素的作用隨

8、分組的不同而不同(P=0.032)。而解毒顆粒組中擬桿菌屬細(xì)菌的占比隨時間變化并不明顯。3、在解毒顆粒組中，可產(chǎn)生丁酸從而起到抗結(jié)腸癌作用的有益菌羅氏菌屬細(xì)菌（Roseburia）隨著時間變化，其占比呈增加趨勢;而在對照組中，羅氏菌屬細(xì)菌的占比隨著時間變化呈減少趨勢，且時間與分組存在交互作用，時間因素的作用隨分組的不同而不同(P=0.029)。4、在解毒顆粒組中，與結(jié)直腸癌相關(guān)的普氏菌屬細(xì)菌（Prevotella）的占比隨時間變化呈減少

9、趨勢;而在對照組中，普氏菌屬細(xì)菌的占比隨時間變化呈增加趨勢。雖然普氏菌屬細(xì)菌的占比在兩組中的變化趨勢比較明顯，兩組在時間、時間與分組的因素上的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。5、在解毒顆粒組中，與結(jié)直腸疾病相關(guān)的毛螺旋菌科細(xì)菌（Lachnospiraceae）的占比隨時間呈輕微減少趨勢;而在對照組中，毛螺旋菌科細(xì)菌的占比隨時間變化呈增加趨勢，且時間與分組存在交互作用，時間因素的作用隨分組的不同而不同(P=0.044)。6、隨著時間的變化，解毒顆粒組

10、的物種比起對照組更為相似。7、對照組中，晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的細(xì)胞中CTLA-4的陽性率及平均熒光強(qiáng)度呈增長趨勢;而在解毒顆粒組中，晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的細(xì)胞中CTLA-4的陽性率及平均熒光強(qiáng)度較前變化不大或呈減少趨勢。兩組患者外周血CD4+和CD8+的細(xì)胞中PD-1的陽性率及平均熒光強(qiáng)度變化趨勢均不明顯。
　　結(jié)論:
　　通過觀察中藥解毒顆粒對BCLC-C肝癌患者腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)解毒顆粒