和厚樸酚保護(hù)腎組織細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥，是各種慢性腎病導(dǎo)致終末期腎病(endstagerenaldisease，ESRD)的主要病因。嚴(yán)格的血糖控制雖然能延緩DN的發(fā)展，但卻不能阻斷DN發(fā)展至ESRD。在過去的幾十年中，系膜細(xì)胞和腎小球基底膜是許多DN相關(guān)研究的焦點(diǎn)。但近來多個(gè)臨床及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的研究證實(shí)，糖尿病腎病中蛋白尿發(fā)生的起始因素與足細(xì)胞病變，如足細(xì)胞肥大、剝離、足細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

2、r>　　 近年來炎癥因素在糖尿病腎病發(fā)病中的作用受到越來越多學(xué)者的重視。腎臟固有細(xì)胞在病理狀態(tài)下可以產(chǎn)生多種炎癥因子，這些因子又通過自分泌和旁分泌的方式使炎癥效應(yīng)不斷擴(kuò)大，從而引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些細(xì)胞因子在糖尿病患者微血管并發(fā)癥，包括糖尿病腎病的發(fā)病中占有重要地位，如誘導(dǎo)發(fā)生胰島素抵抗、增加前列腺素E2的合成、誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖或?qū)δI臟細(xì)胞產(chǎn)生直接的毒性作用。正常狀態(tài)下機(jī)體可產(chǎn)生少量活性氧簇(ROS)參與代謝，同時(shí)體內(nèi)存在清除自由基反

3、應(yīng)的體系，使過多的自由基被清除或使自由基產(chǎn)生減少，從而使ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但是糖尿病可使這一平衡遭到破壞，ROS產(chǎn)生增多或清除減少，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)蓄積而引起多種腎臟細(xì)胞尤其是足細(xì)胞損傷。因此炎癥及氧化應(yīng)激已經(jīng)成為糖尿病腎病治療的重要靶點(diǎn)。尋找及探討既能有效抗炎、抗氧化，而且又無明顯毒副作用的藥物顯得尤為重要。
　　 和厚樸酚(honokiol，HNK)是從木蘭科植物中純化得到的活性成分，是亞洲傳統(tǒng)的醫(yī)藥植物之

4、一。隨著HNK研究進(jìn)展，HNK已被證明具有許多有益的藥理作用，包括抗炎、抗焦慮、抗菌、抗腫瘤及抗氧化等多重作用。因此，本研究將著重評(píng)價(jià)HNK對(duì)高糖、LPS刺激的腎系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激環(huán)境下腎小球上皮即足細(xì)胞凋亡的影響，并通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的變化探討其作用機(jī)制，積極探索及尋找糖尿病腎病的有效治療藥物。
　　 第一部分，和厚樸酚對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞炎性因子表達(dá)的抑制作用
　　 目的：評(píng)估和厚樸酚對(duì)高糖(hi

5、ghglucose，HG)誘導(dǎo)人腎系膜細(xì)胞(humanrenalmesangialcell，HRMC)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。
　　 材料及方法：MTS檢測(cè)不同濃度和厚樸酚作用后HRMC的細(xì)胞增殖活力，以確定和厚樸酚的工作濃度。使用AnnexinV染色，并用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)不同濃度HG對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響，以此確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的HG濃度。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度和厚樸酚對(duì)HG作用后系膜細(xì)胞上清液中炎癥相關(guān)因子白介素(interl

6、eukin，IL)-1β，IL-18，腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)-α，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor，TGF)-β1，CC趨化因子配體[(C-Cmotif)ligand，CCL]-2，CCL-3，CCL-5及前列腺素(prostaglandin，PG)E2蛋白的表達(dá)水平?？傄谎趸?nitricoxide，NO)濃度測(cè)定使用格里斯反應(yīng)方法來測(cè)定。
　　 結(jié)果：和

7、厚樸酚在<20μmol/l濃度時(shí)并未顯著改變HRMC的細(xì)胞增殖活性，但當(dāng)濃度>40μmol/l時(shí)可顯著降低HRMC的細(xì)胞增殖率。經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，50mmol/l的葡萄糖濃度未顯著影響細(xì)胞的凋亡率，因此被作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工作濃度。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50mmol/l的葡萄糖導(dǎo)致HRMC細(xì)胞中的IL-1β、IL-18、TNF-α、PGE2、NO、TGF-β1、CCL-2、CCL-3及CCL-5蛋白水平顯著增加。和厚樸酚(0-20μmol

8、/l)的處理強(qiáng)烈抑制了HG誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-18、TNF-α、PGE2、TGF-β1及NO的蛋白表達(dá)，結(jié)果表現(xiàn)為劑量依賴性。此外，和厚樸酚能抑制趨化因子如CCL-2，CCL-3及CCL-5蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：和厚樸酚能強(qiáng)烈抑制HG刺激的HRMC炎癥因子的表達(dá)增加的作用。和厚樸酚可能是一種有前景的具有強(qiáng)大抗炎作用的藥物。
　　 第二部分，和厚樸酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人腎系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分

9、子的抑制作用
　　 目的：觀察和厚樸酚對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的作用及機(jī)制。
　　 材料及方法：通過MTS法檢測(cè)HRMC的增殖率，確定LPS對(duì)HRMC的毒性濃度。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)初步檢測(cè)不同濃度LPS作用下HRMC中TNF-α與CCL-2的蛋白表達(dá)，并結(jié)合MTS結(jié)果選擇LPS的后續(xù)工作濃度。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)系膜細(xì)胞上清液中炎癥相關(guān)因子I

10、L-1β，IL-18，TNF-α，TGF-β1，CCL-2，CCL3，CCL5及PGE2蛋白的表達(dá)水平，格里斯反應(yīng)法來測(cè)定總NO濃度。Western免疫印跡法測(cè)定總的及磷酸化的核因子-κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)p65亞基、核因子-κB抑制蛋白激酶α/β(inhibitorofkappaBkinasecomplex-alpha/beta，IKKα/β)、核因子κB抑制蛋白(InhibitorkappaB，

11、IκB)-α、絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threoninekinases，Akt)、P42/44絲裂原活化蛋白激酶(P42/44mitogen-activatedproteinkinase，p42/44MAPK)蛋白，環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)-2及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：當(dāng)LPS濃度小于等于1μg/ml時(shí)，

12、隨著LPS濃度的增加TNF-α、CCL-2的蛋白表達(dá)逐漸增加，1μg/ml與2μg/ml時(shí)無明顯區(qū)別。且小于2μg/ml濃度的LPS未對(duì)HRMC的細(xì)胞增殖活性產(chǎn)生影響，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們把LPS1μg/ml作為刺激濃度。本研究中，LPS處理后可導(dǎo)致的HRMC的IL-1β、IL-18、TNF-α、TGF-β1、CCL-2、CCL-3及CCL-5的水平明顯上調(diào)。隨著COX-2及iNOS蛋白表達(dá)的增加，其產(chǎn)物PGE2和NO也有所增加。但這

13、些分子的上調(diào)均被和厚樸酚顯著抑制，且作用呈劑量依賴性。和厚樸酚不僅在10μmol/l時(shí)完全逆轉(zhuǎn)了IL-1β及CCL-3的表達(dá)水平，而且在20μmol/l還完全逆轉(zhuǎn)了TNF-α，IL-18和TGF-β1的表達(dá)。此外，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子NF-κB的p65亞基，IKK-alpha/beta，IκB-α，Akt，p42/44MAPK的磷酸化水平也被和厚樸酚顯著抑制。
　　 結(jié)論：和厚樸酚能抑制LPS誘導(dǎo)HRMC中炎性細(xì)胞因子上調(diào)的作用。其機(jī)

14、制部分可能是由于抑制了NF-κBp65、Akt、p42/44MAPK蛋白的磷酸化及COX-2、iNOS蛋白的途徑發(fā)揮其抗炎作用。
　　 第三部分，和厚樸酚保護(hù)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠足細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究
　　 目的：氧化應(yīng)激是糖尿病等多種疾病導(dǎo)致腎組織損傷的共同因素，也是導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡的重要原因之一。本研究以H2O2刺激下體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞為研究對(duì)象，探討HNK對(duì)足細(xì)胞凋亡及部分細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子表達(dá)的影響從而探討其作用及

15、機(jī)制。
　　 方法：以100μM的H2O2刺激小鼠足細(xì)胞株為研究對(duì)象，加入低(1.25μmol/l)、中(5μmol/l)、高濃度(20μmol/l)的HNK預(yù)處理后：首先在相差顯微鏡下觀察上清中漂浮細(xì)胞的數(shù)量及貼壁細(xì)胞的一般狀態(tài)。使用MTS法及流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)足細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性及凋亡率。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)及免疫的印跡法觀察凋亡蛋白caspase-3及caspase-9的改變。使用免疫印跡法檢測(cè)Erkl/2及Akt信號(hào)

16、分子的磷酸化水平，以進(jìn)一步探討HNK抗氧化作用的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果：加入H2O2這一活性氧簇后，足細(xì)胞增殖率減少，細(xì)胞狀態(tài)變差，光鏡下可見細(xì)胞內(nèi)多量的小黑點(diǎn)，可能為腫脹的細(xì)胞器。MTS及AnnexinV/PI雙染色進(jìn)一步證實(shí)H2O2可導(dǎo)致足細(xì)胞增殖率的下降及細(xì)胞凋亡率的明顯增加。使用不同濃度HNK處理24h后，隨著HNK濃度的增加，上清液中漂浮的死細(xì)胞逐漸減少，貼壁細(xì)胞狀態(tài)好轉(zhuǎn)，細(xì)胞逐漸變得透明，且細(xì)胞增殖率也隨之增加，細(xì)胞

17、凋亡率明顯下降。Real-timePCR及western免疫印跡方法的結(jié)果顯示，HNK可顯著下調(diào)由于H2O2刺激的凋亡相關(guān)半胱氨酰蛋白酶(apoptosis-relatedcysteineprotease，caspase)-3及caspase-9活性蛋白及其mRNA的表達(dá)增加。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-activatedkinases，Erk)1/2及Akt信號(hào)分子的磷酸化水平在加入H2O2后24h未見

18、明顯下降，反而似可見少量增加。且低、中、高濃度HNK進(jìn)一步增加了兩者的磷酸化水平。
　　 結(jié)論：HNK能緩解氧化應(yīng)激環(huán)境促足細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)H2O2培養(yǎng)下足細(xì)胞有保護(hù)作用，且HNK能明顯減少caspase-3及caspase-9活性蛋白及其mRNA的表達(dá)可能是足細(xì)胞凋亡率減少的重要機(jī)制。而HNK使得Erk1/2及Akt信號(hào)分子的磷酸化水平進(jìn)一步增加可能也是其作用機(jī)制之一。但仍需進(jìn)一步檢測(cè)Erk1/2及Akt蛋白的時(shí)間.磷酸化效