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文檔簡介
1、和厚樸酚是中藥厚樸的主要化學(xué)成分。據(jù)報道:和厚樸酚具有多途徑抗腫瘤機制,如誘導(dǎo)細胞增殖與分化,引起細胞凋亡,其機制與上調(diào)促凋亡因子Bid、下調(diào)抑凋亡因子Bcl-XL,以及激活p53非依賴、線粒體依賴的Caspase通路有關(guān)。由于動物實驗需要,我們需要找到一種高效快速的分離技術(shù)純化出大量的和厚樸酚,高速逆流色譜儀是一種液液分離裝置,經(jīng)過多年的改進,發(fā)展為一種快速的分離技術(shù),可以和高效液相色譜媲美,是一種分離天然藥物的理想的設(shè)備。SILAC
2、技術(shù):即是用同位素標(biāo)記必需氨基酸,將它加到缺乏此氨基酸的培養(yǎng)基,用此培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,經(jīng)過細胞代謝,標(biāo)記的氨基酸融合到蛋白中,形成內(nèi)碼子。它與質(zhì)譜結(jié)合,為定量蛋白組提供了和好的技術(shù)。本文旨在用高速逆流色譜從植物厚樸中大規(guī)模分離和厚樸酚,并利用SILAC技術(shù),將和厚樸酚治療同位素標(biāo)記的肝癌細胞HepG2,通過質(zhì)譜鑒定,用定量蛋白組的方法鑒定出和厚樸酚引起的蛋白調(diào)控,從而確定出和厚樸酚抗腫瘤的作用機理。 方法:使用英國布魯內(nèi)爾提供的分
3、析型HSCCC優(yōu)化分離的條件,包括流速、進樣濃度、進樣量。并將優(yōu)化的條件放大到制備型HSCCC。大規(guī)模分離純化出和厚樸酚。用和厚樸酚治療經(jīng)亮氨酸--d3完全標(biāo)記的肝癌細胞HepG2,提取蛋白,利用質(zhì)譜檢測總蛋白,以保守蛋白β--actine為標(biāo)準(zhǔn),確定出和厚樸酚引起調(diào)控的蛋白。推斷出和厚樸酚抗腫瘤作用機理。 結(jié)果:經(jīng)分析型HSCC優(yōu)化,逆流色譜分離的條件為:轉(zhuǎn)速為每分鐘1800轉(zhuǎn);流速為每分鐘2.5毫升;進樣量為分離柱的5%;進
4、樣濃度為每毫升80毫克。這些優(yōu)化的條件成功的運用到制備型高速逆流色譜。在大規(guī)模分離純化和厚樸酚與厚樸酚中,我們用三種不同的濃度(20mg/ml,75mg/ml,250mg/ml)進樣,從59.2克粗品中分離出純度高達99.9%的厚樸酚24.7克與純度高達98.6%的和厚樸酚23.2克。我們用10 μ g/ml濃度和厚樸酚作用HepG2細胞24h。通過質(zhì)譜鑒定了290個蛋白,其中和厚樸酚引起蛋白上調(diào)占了5.5%,下調(diào)蛋白占了72.4%;與
5、細胞凋亡相關(guān)的蛋白有23個。 結(jié)論:本文中,我們成功利用了HSCCC大規(guī)模純化和厚樸酚。采用SILAC技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)了和厚樸酚引起的蛋白調(diào)控,其中在與細胞凋亡相關(guān)的蛋白中,我們選擇 Ras GTPase-activating-like protein IQGAPl(p195)與 94kDaglucose-regulated protein(GRP94)進行PCR與Westen-blot驗證。證實了和厚樸酚可能通過引起一系列的蛋白
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