肥大細(xì)胞羧肽酶與類糜蛋白酶在血管生成中的作用的初步研究.pdf

1、[目的]
　　1.建立體內(nèi)Matrigel血管生成模型，利用該模型研究肥大細(xì)胞類糜蛋白酶(mast cell chymase，MC-Chy)的促血管生成作用。
　　2.利用體內(nèi)Matrigel血管生成模型研究肥大細(xì)胞羧肽酶(mast cellcarboxypeptidase，MC-CP)在血管生成中的作用，以及MC-CP對(duì)MC-Chy促血管生成作用的影響。
　　[方法]
　　1.建立小鼠體內(nèi)Matrigel血管生

2、成模型，研究人MC-Chy的促血管生成作用。
　　(1)大量提取人MC-Chy真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/S-Chy。
　　(2)人MC-Chy真核表達(dá)質(zhì)粒與Matrigel混合后于小鼠腹股溝部皮下注射，建立體內(nèi)Matrigel血管生成模型，分別設(shè)立生理鹽水及MC-Chy抑制劑對(duì)照組。
　　(3)實(shí)驗(yàn)第12天處死小鼠，取出膠體組織并切半，一半以4ml/g的比例加入超純水用于血紅蛋白(Hb)及酶活性的測(cè)定，另一半用4％

3、甲醛固定常規(guī)包埋切片，用于HE染色和血管內(nèi)皮細(xì)胞(CD34)免疫組織化學(xué)(IHC)染色并計(jì)數(shù)血管密度(MVD)。
　　2.人肥大細(xì)胞羧肽酶真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1/MC-CP)體內(nèi)表達(dá)的研究。
　　(1)分別大量提取人MC-CP分泌型與非分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/S-CP、 pcDNA3.1/CP。
　　(2)利用質(zhì)粒DNA pcDNA3.1/S-CP和pcDNA3.1/CP分別通過皮下及肌肉兩種途徑進(jìn)

4、行小鼠注射，用ELISA法檢測(cè)上述兩種質(zhì)粒DNA在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。
　　(3)質(zhì)粒DNA在體內(nèi)Matrigel血管生成模型中表達(dá)的檢測(cè)，質(zhì)粒DNApcDNA3.1/S-CP和pcDNA3.1/CP分別與Matrigel混合后于小鼠腹股溝皮下注射，實(shí)驗(yàn)的第12天處死小鼠，取出Matrigel檢測(cè)是否具有活性MC-CP的表達(dá)。
　　3.MC-CP在血管生成中的作用，以及MC-CP對(duì)MC-Chy促血管生成作用的影響。
　

5、　(1)分離大鼠腹腔肥大細(xì)胞(RPMCs)。
　　(2)用鈣離子載體(A23187)刺激RPMCs，使其活化脫顆粒，產(chǎn)生具有MC-CP與MC-Chy活性的細(xì)胞活化產(chǎn)物。
　　(3)利用體內(nèi)Matrigel血管生成模型，研究MC-CP在血管生成中作用，以及MC-CP對(duì)MC-Chy促血管生成作用的影響。
　　[結(jié)果]
　　1.成功建立BALB/c小鼠體內(nèi)Matrigel血管生成模型，用于分析人MC-Chy在血管生成中

6、的作用，膠體組織中可以檢測(cè)到具有酶活性的MC-Chy，血紅蛋白(Hb)含量分析顯示，pcDNA3.1/S-Chy表達(dá)質(zhì)粒處理組的Hb含量明顯比對(duì)照組高;HE染色及IHC染色發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1/S-Chy質(zhì)粒處理組的血管密度高于對(duì)照組，表明人MC-Chy具有促血管生的成作用。而MC-Chy的特異性抑制劑CHI(Chymostatin, CHI)組與對(duì)照組沒有顯著差異，提示該作用可以被MC-Chy的特異性抑制劑CHI所抑制。
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7、.質(zhì)粒DNA pcDNA3.1/S-CP與pcDNA3.1/CP分別通過皮下及肌肉注射兩種途徑進(jìn)行小鼠注射，ELISA法可以檢測(cè)到上述兩種質(zhì)粒DNA在小鼠體內(nèi)的表達(dá)，而在體內(nèi)Matrigel血管生成模型中未檢測(cè)到具有活性的人MC-CP。
　　3.成功分離RPMCs，用鈣離子載體(A23187)刺激后，獲得具有MC-CP與MC-Chy活性的細(xì)胞活化產(chǎn)物，體內(nèi)Matrigel血管生成模型顯示MC-Chy可以顯著的促進(jìn)血管生成，而未檢測(cè)

8、到MC-CP明顯的促血管生成作用，也未觀察到MC-CP對(duì)MC-Chy促血管生成作用的影響。
　　[結(jié)論]
　　1.成功建立體內(nèi)Matrigel血管生成模型，用該模型研究表明人MC-Chy真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/S-Chy體內(nèi)表達(dá)的MC-Chy具有促血管生成的作用，同時(shí)該作用可以被MC-Chy的特異性抑制劑CHI(Chymostatin，CHI)抑制。
　　2.質(zhì)粒DNA pcDNA3.1/S-CP和pcDNA3.

9、1/CP分別通過皮下及肌肉注射兩種途徑進(jìn)行小鼠注射，均可以檢測(cè)到二者在體內(nèi)的表達(dá)，而在體內(nèi)Matrigel血管生成模型中未檢測(cè)到活性MC-CP的表達(dá)，提示該方法可能無法表達(dá)出具有活性的人MC-CP。
　　3.體內(nèi)Matrigel血管生成模型顯示RPMCs活化脫顆粒產(chǎn)生的MC-Chy可以顯著的促進(jìn)血管生成，而未觀察到RPMCs活化脫顆粒產(chǎn)生的MC-CP有明顯的促血管生成作用，也未觀察到MC-CP對(duì)MC-Chy的促血管生成作用有明顯影