人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HT-29-5-Fu的構(gòu)建及基因表達(dá)譜變化.pdf

1、目的：采用人結(jié)腸癌HT-29為親本細(xì)胞株，持續(xù)藥物濃度遞增法構(gòu)建人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株，細(xì)胞學(xué)觀察腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性變化，全人類(lèi)基因組表達(dá)譜芯片分析比較兩株細(xì)胞基因表達(dá)譜差異，初步探索結(jié)腸癌細(xì)胞中可能與5-Fu耐藥相關(guān)的基因，為今后進(jìn)一步研究耐藥機(jī)制、篩選耐藥分子標(biāo)記物奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴采用5-Fu持續(xù)接觸濃度梯度遞增法構(gòu)建人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HT-29/5-Fu；⑵觀察耐藥細(xì)胞株HT-29/5-Fu的生物學(xué)特性：觀察細(xì)胞形態(tài)變化

2、和克隆形成率；MTT法測(cè)定生長(zhǎng)曲線(xiàn)和藥物敏感性；Western blot分析胸苷酸合成酶（TS）、二氫嘧啶脫氫酶（DPD）的表達(dá)情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡；⑶利用全人類(lèi)基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)耐藥細(xì)胞株HT-29/5-Fu及其親本HT-29細(xì)胞差異表達(dá)的基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)的方法篩選出可能與5-Fu耐藥相關(guān)的基因及通路。
　　結(jié)果：①歷時(shí)10個(gè)月成功建立了能在1μg/mL5-Fu濃度下穩(wěn)定生長(zhǎng)的耐藥細(xì)胞株HT-29/5-Fu

3、；②HT-29/5-Fu耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變，其耐藥指數(shù)為3.59；與HT-29細(xì)胞相比，HT-29/5-Fu細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，生長(zhǎng)緩慢，克隆形成率降低，TS和DPD高表達(dá)，S期細(xì)胞比例增多，更能耐受5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；③基因芯片結(jié)果顯示：HT-29/5-Fu耐藥細(xì)胞與其親本HT-29細(xì)胞相比，共有211個(gè)差異表達(dá)的基因（變化倍數(shù)≥2或≤0.5），其中有115個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（變化倍數(shù)≥2），96個(gè)基因下調(diào)（變化倍數(shù)≤0.5）

4、。這些表達(dá)失調(diào)的基因中有17個(gè)基因已被報(bào)道過(guò)與各種化療藥物耐藥相關(guān)，其中與5-Fu耐藥密切相關(guān)的基因包括編碼5-Fu作用靶酶的TYMS、ABCG2、YES1和MDK。另外，某些差異表達(dá)的基因還與多藥耐藥（M DR）、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EM T）、腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、抗凋亡和細(xì)胞周期捕獲等相關(guān)。GO（基因功能）分析結(jié)果顯示上述差異表達(dá)基因在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、DN A結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能方面得到了富集。KEGG通路分析顯示