2型糖尿病腎病大鼠腎臟組織中MK與CTGF變化的實驗研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是一種威脅糖尿病(diabetesmellitus，DM)患者生命的并發(fā)癥，在許多國家DN已成為導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的首要原因。DN病程進(jìn)展具有從高濾過狀態(tài)到微量白蛋白尿到大量白蛋白尿再到腎功能衰竭的順序進(jìn)行的特點(diǎn)，在此過程中伴隨多種機(jī)制的參與，包括多元醇、PKC途徑的激活、蛋白非酶糖基化、大分子終末產(chǎn)物的合成和細(xì)胞因子等。DN雖然未被認(rèn)為是炎癥性疾病，但是越來越多的證據(jù)

2、表明炎癥細(xì)胞因子參與了它的發(fā)病機(jī)制。然而目前為止，僅有轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growm factor-β，TGF-β)，結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth facton，CTGF)等少數(shù)細(xì)胞因子被確認(rèn)為在此炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。CTGF是介導(dǎo)TGF-β致纖維化作用的下游因子，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。它在DN腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷的發(fā)展中起到重要作用。中期因子midkine(

3、MK)是一種肝素結(jié)合細(xì)胞因子，參與神經(jīng)元的生存和分化，腫瘤疾病的發(fā)展以及一些炎癥相關(guān)性疾病。最近研究證明MK在DN的發(fā)病機(jī)制中也起到至關(guān)重要的作用。我們發(fā)現(xiàn)MK基因敲除(mdk-/-)的小鼠與有.MK基因的小鼠相比，能顯著延緩DN的發(fā)生。然而在DN中MK與其它細(xì)胞因子是否相關(guān)尚無報道。本研究通過MK反義寡聚脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleortides，AS-ODNs)技術(shù)對早期DN進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠腎臟組

4、織MK和CTGF表達(dá)水平的變化以及探討MK AS-ODNs在早期DN中的治療前景。
　　方法：雄性清潔級8周齡SD大鼠30只，體重200～250 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后完全隨機(jī)法分為正常組、DN組和MKAS-ODNs組各10只。DN組和MKAS-ODNs組均行單側(cè)腎臟切除術(shù)，高糖高脂飼料飼養(yǎng)4周，隨后尾靜脈注射STZ30 mg/kg；正常組行切皮假手術(shù)，普通飼料飼養(yǎng)4周，尾靜脈注射檸檬酸緩沖液30 mg/kg。注射STZ1周采用葡萄

5、糖氧化酶法連續(xù)監(jiān)測3天隨機(jī)血糖均≥16.7mmol/L作為DM造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。分別于DM成模后第0、3、6周監(jiān)測飲水量，尿量，體重及24h尿微量白蛋白的變化，成模第6周，MK AS-ODNs組尾靜脈注射MK AS-ODNs1 mg/kg，正常組和DN組予等量生理鹽水尾靜脈注射，干預(yù)4天后留取24 h尿，處死后快速取出腎臟稱重，部分腎臟浸于福爾馬林溶液中用于病理、免疫組化，部分液氮速冷后-80℃保存用于RT-PCR。
　　結(jié)果：1、

6、糖尿病造模成功后DN組和MK AS-ODNs組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食、體重下降，毛發(fā)枯黃，無光澤，行動遲緩等癥狀。成模第6周DN組和MK AS-ODNs組大鼠開始出現(xiàn)24 h尿微量白蛋白升高且與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。腎臟大體形態(tài)顯示：體積增大，重量增加，髓質(zhì)部分空虛，且腎重體重比值較正常組明顯增加(P<0.05)。腎臟組織病理學(xué)改變明顯，2型早期糖尿病腎病模型制備成功。2、免疫組織化學(xué)和實時熒光定量PCR結(jié)果

7、均顯示：正常組大鼠腎臟組織MK和CTGF的表達(dá)水平極低，DN組大鼠腎臟組織中MK和CTGF的表達(dá)水平較正常組明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MK AS-ODNs組大鼠腎臟組織中MK和CTGF的表達(dá)水平較DN組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。3、MK和CTGF在早期T2DN大鼠腎臟組織中的表達(dá)相關(guān)性研究表明：在早期T2DN大鼠腎臟組織中MK與CTGF的表達(dá)具有直線相關(guān)關(guān)系，且為正相關(guān)(r=0.498，P<0.05)