幾種布魯菌抗原的免疫學特性研究.pdf

1、布魯菌（Brucella）是布魯菌?。˙rucellosis）的病原體。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)布魯菌有7個生物種：羊布魯菌（B.melitensis）、牛布魯菌（B.abortus）、豬布魯菌（B.suis）、犬布魯菌（B.canis）、綿羊布魯菌（B.ovis）、鼠布魯菌（B.neotomae）和海洋哺乳動物布魯菌（B.maris）。各種間具有高度的同源性，但在毒力、生物學性狀以及感染人類或畜類后的臨床表現(xiàn)和流行特征等方面存在差異。其中既可以感染畜

2、類也可以感染人類的生物種有羊、牛、豬和犬布魯菌。在我國流行的主要有羊、牛和豬布魯菌三種，且以羊布魯菌最為常見，其致病力也最強。
　　布魯菌是一種細胞內寄生的革蘭陰性菌，感染后可以誘導機體產(chǎn)生保護性體液免疫和細胞免疫反應。細胞免疫可清除細胞內布魯菌，在抗布魯菌感染免疫中占主要地位?，F(xiàn)有的布魯菌疫苗為滅活疫苗和減毒活疫苗，在一定程度上對于疫情的預防和控制起到積極作用，但是也存在一些問題：（1）滅活疫苗雖然可以起到一定的保護作用，但是免

3、疫效果比較有限，不能引起足夠的細胞免疫應答；（2）減毒活疫苗由于毒力恢復反彈而感染動物或人類，其應用受到限制；（3）在疫區(qū)篩查檢測時，常用的血清學方法如試管凝集試驗等無法區(qū)分傳統(tǒng)疫苗免疫的動物和受到布魯菌感染的動物，這對于隔離病畜，進而防治疫情擴散起到制約作用。因此，國內外均在進行布魯菌新型疫苗包括DNA疫苗的研究。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些具有保護作用的布魯菌抗原基因，如編碼L7/L12、BCSP31和OMP31等抗原的基因。單獨的保護抗原

4、基因雖然可以誘導一定的免疫反應，起到一定的保護作用，但是存在保護效果較差，保護時間較短等缺陷。因此，研制聯(lián)合多個保護性抗原基因的DNA疫苗是布魯菌疫苗研究的熱點之一。
　　本課題在前期研究的基礎上，對布魯菌rp1L、omp31、bcsp31、omp22、omp2b等基因進行免疫學分析研究：制備了相應的單克隆抗體（monoclonalantibody，mAb）；對多個抗原基因的各種組合進行了免疫學分析，以期篩選出最佳的組合方式。

5、r>　　1、幾種布魯菌外膜蛋白的表達、純化及其單克隆抗體的制備
　　構建了幾種布魯菌外膜蛋白基因的原核表達載體，并將其分別命名為pGEX-4T-1-omp31、pGEX-4T-1-omp22、pGEX-4T-1-omp25d、pGEX-4T-1-omp2b。將這些質粒分別轉化至大腸埃希菌并誘導表達，采用GST親和層析純化的方法，分別獲得純化的布魯菌OMP31、OMP22、OMP25d和OMP2b蛋白。用純化的蛋白檢測布魯菌全菌免疫

6、的BALB/c小鼠血清，取高效價的小鼠脾細胞與骨髓瘤Sp2/0細胞融合，ELISA間接法篩選陽性克隆，3次克隆化后建立雜交瘤細胞系。采用小鼠腹腔接種雜交瘤細胞制備腹水，正辛酸－硫酸銨法純化mAb。采用Westernblot和ELISA等方法鑒定mAb特性。
　　結果獲得了2株抗布魯菌OMP22蛋白的mAb，2株抗布魯菌OMP25d蛋白的mAb，2株抗布魯菌OMP31蛋白的mAb以及1株抗布魯菌OMP2b蛋白的mAb。這7株單克隆抗

7、體特異性強、敏感性較好，與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、結核分枝桿菌和綠膿假單胞菌等無交叉反應。
　　2、重組DNA的制備和動物免疫
　　分別構建了pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31、pcDNA3.1-bcsp31、pcDNA3.1-omp22和pcDNA3.1-omp2b真核表達載體。分別用這些質粒轉染CHO細胞，其所表達的蛋白可被兔抗布魯菌血清識別。再將上述質粒大量提取和純化，并按照如下

8、方式進行組合后分別免疫C57BL/6小鼠，并檢測各項免疫學指標，以減毒活疫苗M5株和生理鹽水為對照。
　?。?）將pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31三組重組DNA等量混合免疫C57BL/6小鼠，并將這種組合命名為ROB。
　?。?）將pcDNA3.1-omp22和pcDNA3.1-omp2b分別免疫C57BL/6小鼠。
　　（3）將ROB和pcDNA3.1-omp2

9、2（命名為4Ⅰ）；ROB和pcDNA3.1-omp2b（4Ⅱ）；ROB和pcDNA3.1-omp22、pcDNA3.1-omp2b（5Ⅲ）三組分別免疫C57BL/6小鼠。
　　3、重組DNA免疫效果的評價
　　ROB組重組DNA免疫小鼠在末次免疫后4周的抗體水平最高，平均抗體滴度為1:1280（P<0.01）；所產(chǎn)生的Th1型細胞因子如TNF-α和IFN-γ等均比M5株對照組高出2倍以上（P<0.05）；所誘導的脾淋巴細胞增

10、殖能力明顯強于M5株對照組（P<0.05）；并具有更強的細胞殺傷能力（P<0.05），提示獲得的ROB重組DNA在細胞免疫水平方面要強于M5疫苗株。
　　布魯菌omp22組和omp2b組均刺激了較高的體液免疫水平（均大于1:1000，P<0.05）；在檢測IgG2a/IgG1比值方面，omp22組和omp2b組均優(yōu)于M5組（P<0.05）；omp2b組誘導的TNF-α和IFN-γ水平高于M5組（P<0.05）；pcDNA3.1-o

11、mp2b免疫動物的脾細胞經(jīng)特異性抗原刺激后，所產(chǎn)生的IFN-γ的細胞數(shù)目約是M5組的4倍（P<0.05）；CTL殺傷實驗表明，在效靶比為100時，omp2b組的殺傷能力明顯強于M5組（P<0.05）。omp22組的各項指標也明顯好于M5組，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　Ⅱ4組所誘導的特異性IgG為1:1280（P<0.05）；IgG2a/IgG1比值是2.8（P<0.05）。在細胞免疫方面，Ⅱ4組誘導的TNF-α和IFN

12、-γ高于M5組（P<0.05）；Ⅱ4組免疫小鼠的脾細胞經(jīng)特異性抗原刺激后能產(chǎn)生IFN-γ的細胞數(shù)目為64±3.4，高于M5組（P<0.05）；CTL殺傷實驗表明，在效靶比為100時，Ⅱ4組的殺傷效果優(yōu)于M5組（P<0.05）。
　　將Ⅱ4組和ROB組數(shù)據(jù)進行比對，其免疫效果優(yōu)于原先ROB組，也優(yōu)于M5疫苗組，我們將這四種抗原基因組成的組合命名為ROBO。
　　綜上所述，重組DNA所引起的細胞免疫應答水平要高于傳統(tǒng)疫苗，本實驗