HRE調(diào)控VEGF表達(dá)轉(zhuǎn)染NSCs的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:獲得表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)的基因工程神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)，研究缺氧反應(yīng)元件(hypoxia-reponsive element，HRE)在缺氧條件下是否能提高VEGF基因的表達(dá)，以期為缺氧缺血性腦損傷尋求一種安全、高效的基因治療方法。
　　方法:分離胎齡14天的SD大鼠胚胎前腦皮質(zhì)，采用無(wú)血清培養(yǎng)的方法獲得細(xì)胞

2、克隆，應(yīng)用間接免疫熒光法鑒定NSCs和分化的神經(jīng)細(xì)胞。構(gòu)建攜帶VEGF165基因的兩種重組慢病毒載體pGC-FU-VEGF165，及9HRE-pGC-FU-VEGF165，將兩者分別轉(zhuǎn)染NSCs細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的NSCs分為7組:A組為轉(zhuǎn)染pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞、B1組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，B2組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEG

3、F165重組慢病毒后于缺氧條件下培養(yǎng)6h的神經(jīng)干細(xì)胞，B3組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于缺氧條件下培養(yǎng)12h的神經(jīng)干細(xì)胞，B4組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于缺氧條件下培養(yǎng)24h的神經(jīng)干細(xì)胞，C組為轉(zhuǎn)染空載體慢病毒于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，D組為未轉(zhuǎn)染慢病毒于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞作為的空白對(duì)照組，（常氧條件為95％O2+5％CO2;缺氧條件為2％O2+98％N2）;熒光

4、顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率，采用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因NSCs的VEGF基因表達(dá)水平，Western-blot及Elisa檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分泌型血管內(nèi)皮生長(zhǎng)蛋白的表達(dá)水平，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NSCs的增殖活性。
　　結(jié)果:
　?、匐x體培養(yǎng)的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞呈Nestin陽(yáng)性;
　?、诮?jīng)測(cè)序兩組目的基因與GenBbank中序列完全一致，成功構(gòu)建HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒、pGC-FU-VEGF165

5、慢病毒載體;
　　③將慢病毒轉(zhuǎn)染至神經(jīng)干細(xì)胞分組后在熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)A組、B2組、B3組、B4組、C組基因工程神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，B1組、D組未見(jiàn)綠色熒光;經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)A組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率50％左右， B2組、B3組、B4組、C組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為80％左右，B1組、D組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為0.49％左右;
　?、躌T-PCR檢測(cè)C組、D組、B1組細(xì)胞無(wú)明顯VEGFmRNA表達(dá)，B2組、B3組、B4組、A組細(xì)胞均表達(dá)VEGFmRNA

6、，B2組、B3組、B4組細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)量顯著高于A組(P＜0.05），且B組內(nèi)細(xì)胞隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)VEGFmRNA表達(dá)量增高(P＜0.05）;
　?、軼estern-blot檢測(cè)C組、D組、B1組無(wú)明顯VEGF蛋白表達(dá)，B2組、B3組、B4組、A組細(xì)胞均表達(dá)VEGF蛋白，B2組、B3組、B4組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量高于A組(P＜0.05），且B組內(nèi)細(xì)胞隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)VEGF蛋白表達(dá)量增高（P＜0.05）;
　?、?/p>

7、Elisa檢測(cè)C組、D組、B1組無(wú)明顯分泌型VEGF蛋白表達(dá)，B2組、B3組、B4組、A組細(xì)胞可表達(dá)分泌型VEGF蛋白，B2組、B3組、B4組細(xì)胞分泌型VEGF蛋白表達(dá)量高于A組(P＜0.05），且B組內(nèi)細(xì)胞隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)分泌型VEGF蛋白表達(dá)量增高（P＜0.05）;
　?、進(jìn)TT檢測(cè)示C組、D組細(xì)胞增殖活性無(wú)差異(P＞0.05)，A組、B2組細(xì)胞增殖活性均高于與C組、D組(P＜0.05)，B2組細(xì)胞增殖活性高于A組(P＜0.0