磁標(biāo)記BMSCs移植治療大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的在體MR研究.pdf

1、研究目的
　　 本實(shí)驗(yàn)采用體外分離、培養(yǎng)并不同濃度的超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxid，SPIO)標(biāo)記骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stemcells，BMSCs)，旨在明確不同濃度SPIO對BMSCs的活性影響；觀察磁標(biāo)記BMSCs在體MR成像時(shí)各序列特征，以期求得活體監(jiān)測SPIO標(biāo)記細(xì)胞的優(yōu)選序列；動態(tài)觀察創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)大鼠損傷

2、對側(cè)細(xì)胞移植后神經(jīng)功能恢復(fù)及MR活體成像特點(diǎn)及規(guī)律，為臨床干細(xì)胞移植治療創(chuàng)傷性腦損傷的療效觀察與新方法開創(chuàng)提供依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.BMSCs的培養(yǎng)及鑒定：采用全骨髓貼壁法對BMSCs進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、純化，觀察細(xì)胞光鏡及透射電鏡下的形態(tài)；對所獲得的細(xì)胞進(jìn)行表面抗原(CD34、CD44、CD45、CD105)檢測；采用DMSO+BHA誘導(dǎo)進(jìn)行神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并用免疫組化的方法檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶

3、(neuronspecific enolase，NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidiacprotein，GFAP)及神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(Nestin)的表達(dá)。
　　 2.標(biāo)記細(xì)胞的鑒定及活性分析：不同濃度SPIO(Resovist)標(biāo)記BMSCs，普魯士藍(lán)染色及電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)鐵，并通過MTT法分析不同濃度Resovist對細(xì)胞活性的影響。
　　 3.標(biāo)記細(xì)胞的腦內(nèi)立體定位注射及

4、MR活體示蹤：采用Feeney's自由落體方法制備大鼠TBI模型，實(shí)驗(yàn)動物共分4組，A組：TBI后損傷對側(cè)移植SPIO標(biāo)記BMSCs；B組：TBI后移植未標(biāo)記BMSCs；C組：TBI后移植純培養(yǎng)液；D組(假手術(shù)組)：僅切開頭皮不進(jìn)行損傷和移植。移植后不同時(shí)間點(diǎn)(1天、1周、2周及4周)進(jìn)行MR的TSE：T1WI、T2WI，GRE：T2*WI及磁敏感加權(quán)(susceptibility weighted imaging，SWI)序列動態(tài)觀察

5、其分布及遷徙。并經(jīng)神經(jīng)功能評分(參照平衡木試驗(yàn)的評分方法)對大鼠進(jìn)行功能測試，評價(jià)細(xì)胞移植的療效，最后經(jīng)組織學(xué)檢查驗(yàn)證標(biāo)記細(xì)胞在腦內(nèi)的存活及遷徙。
　　 結(jié)果：
　　 1.全骨髓貼壁法培養(yǎng)至P3代后，光鏡下細(xì)胞表現(xiàn)為均勻分布的梭形成纖維樣細(xì)胞；透射電鏡下表現(xiàn)為兩種不同的結(jié)構(gòu)類型；免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示CD34、CD45表達(dá)陰性，CD44及CD105表達(dá)陽性；神經(jīng)方向誘導(dǎo)6h后，倒置相差顯微鏡下細(xì)胞呈神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)

6、，免疫細(xì)胞化學(xué)染色NSE、GAFP、Nestin呈陽性表達(dá)。
　　 2.Resovist標(biāo)記BMSCs后，光鏡下可見胞漿內(nèi)散在分布的棕黃色顆粒；普魯士藍(lán)染色胞質(zhì)內(nèi)可見陽性藍(lán)色顆粒；電鏡觀察可見標(biāo)記BMSCs胞質(zhì)內(nèi)含有許多包裹鐵顆粒的囊泡。MTT比色試驗(yàn)結(jié)果顯示14μg～112μg Fe/ml培養(yǎng)液對細(xì)胞活性沒有影響。
　　 3.BMSCs移植后1天、1周、2周及4周的神經(jīng)功能評分顯示A組和C組、B組和C組評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義，而A組和B組評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MR檢查結(jié)果顯示A組實(shí)驗(yàn)動物注射區(qū)在TSE：T1WI、T2WI，GRE：T2*WI及SWI四個(gè)序列均可顯示低信號，以T2，WI及AWI信號丟失明顯，其中SWI最敏感。且在2周及4周時(shí)的SWI序列上更清楚的顯示線樣低信號沿胼胝體逐漸向損傷區(qū)遷移，組織普魯士藍(lán)染色亦證實(shí)標(biāo)記BMSCs沿胼胝體向?qū)?cè)的遷移。
　　 結(jié)論：
　　 1.無需轉(zhuǎn)染介質(zhì)，Resovist能夠高效的進(jìn)入BMSCs胞