雷帕霉素在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后空間記憶功能保護(hù)作用的研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是常見的致死、致殘性疾病，損傷后可出現(xiàn)認(rèn)知記憶障礙、行為異常等變化，是目前影響人類健康的世界性難題。隨著我國經(jīng)濟(jì)與交通的快速發(fā)展，創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生率也同比增加。盡管創(chuàng)傷性腦損傷的救治體系和方案不斷完善，但其死殘率仍居高不下。而目前創(chuàng)傷性腦損傷的損傷機(jī)制仍不清楚，因此，進(jìn)一步深入研究創(chuàng)傷性腦損傷的病理分子機(jī)制將成為神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究重點。
　　近來，自噬(Autophagy)作為神經(jīng)細(xì)胞另一種程序性死亡方式越

2、來越受到關(guān)注，但其具體機(jī)制尚不清楚。自噬是通過溶酶體機(jī)制和微管系統(tǒng)等共同作用的一種代謝途徑。它在神經(jīng)元中起清除和再利用細(xì)胞成分的作用，并參與多種病理生理過程。創(chuàng)傷性腦損傷后，啟動自噬可保護(hù)受傷的神經(jīng)細(xì)胞，避免其趨向死亡，及時清除已損害的細(xì)胞、毒性興奮性氨基酸、自由基及代謝廢物等，對損傷后或應(yīng)激狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞的存活起著重要的作用。
　　雷帕霉素（Rapamycin）是經(jīng)典的mTOR受體抑制劑，通過特異地抑制mTORC1從而介導(dǎo)下游自

3、噬信號途徑的激活，其中，mTOR受體在自噬的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。近年來，雷帕霉素激動自噬在神經(jīng)細(xì)胞損傷后的保護(hù)作用也逐漸被人們認(rèn)識并引起重視。
　　在本研究中：（一）應(yīng)用大鼠側(cè)方液壓腦損傷模型，傷后6周大鼠空間記憶功能出現(xiàn)障礙，損傷側(cè)海馬組織自噬相關(guān)蛋白明顯減少;（二）給予自噬激動劑雷帕霉素后，TBI后6周，大鼠空間記憶功能改善;（三）TBI后應(yīng)用雷帕霉素大鼠損傷側(cè)海馬組織自噬增強(qiáng)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制。
　　第一部分中型創(chuàng)傷性腦

4、損傷后大鼠空間記憶功能和自噬變化
　　一、目的
　　(1)構(gòu)建中型側(cè)方液壓腦打擊損傷大鼠模型;
　　(2)驗證TBI后大鼠認(rèn)知空間記憶的改變;
　　(3)觀察TBI后大鼠損傷側(cè)海馬組織自噬變化。
　　二、材料和方法
　　1、成年雄性SD大鼠，體重(190±15)g，飼養(yǎng)3周后，體重為(350±20)g，大鼠行開顱鉆孔手術(shù)，鉆孔中心位于前囟后4.5mm，中線旁開左側(cè)3mm，鉆孔直徑0.5cm，切開頭皮，

5、移除骨窗，避免損傷硬膜，采用磷酸鋅水門汀齒科固定材料固定液壓打擊處，連接液壓打擊儀，給予2.12±0.03倍大氣壓強(qiáng)度打擊;假手術(shù)對照組(Sham)只切開皮膚，鉆孔后縫合。傷后每日記錄大鼠體重并描繪變化曲線，對于體重減輕超過體重50％以上或感染嚴(yán)重或瀕死的大鼠，退出實驗。
　　2、成年雄性SD大鼠25只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為TBI組，數(shù)量為15只;假手術(shù)組(Sham)，數(shù)量為10只。
　　3、傷后6周，第36～40天行Mor

6、ris水迷宮測試，訓(xùn)練總天數(shù)為5天，分為空間記憶定位測試、空間探索功能測試兩部分，主要檢測大鼠損傷后短期記憶及空間探索能力，用于評估TBI后大鼠學(xué)習(xí)和記憶存儲功能變化。
　　4、行為學(xué)測試最后一天（傷后40天），分別隨機(jī)抽取不同組別大鼠，待麻醉滿意后，迅速斷頭，冰上取損傷側(cè)海馬組織（30 s內(nèi)），進(jìn)一步提取總蛋白并檢測。配置體積分?jǐn)?shù)為15％分離膠，行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，放入封閉液中封閉，后將P

7、VDF膜放入分別含一抗內(nèi)參β-actin(1∶5000)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)(1∶1000)、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1(1∶500)雜交袋中，置于4°搖床過夜，用PBST洗膜3次，每次5 min，后孵育結(jié)合熒光二抗1.5h，再次避光洗膜3次后熒光掃膜顯色。觀察自噬相關(guān)蛋白表達(dá)差異。
　　三、結(jié)果
　　1、Morris水迷宮數(shù)據(jù)提示中型創(chuàng)傷性腦損傷可導(dǎo)致大鼠空間記憶功能障礙。水迷宮實驗第5天，TBI組與Sham

8、組相比，潛伏期P（入水至找到逃生平臺所需時間）明顯縮短?？臻g探索測試結(jié)果提示，TBI組較假手術(shù)組在目標(biāo)象限滯留時間明顯縮短，表現(xiàn)出區(qū)域偏好性差或不存在。
　　2、Western-blot結(jié)果提示，傷后6周，TBI組與Sham組比較，損傷側(cè)海馬組織自噬蛋白Beclin-1和LC3出現(xiàn)明顯下降。
　　四、結(jié)論
　　1、中度TBI后，大鼠海馬結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷，伴隨空間記憶功能障礙;
　　2、損傷側(cè)海馬組織在TBI后期（損傷

9、后40天）自噬減弱。
　　第二部分雷帕霉素誘導(dǎo)自噬對中型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠認(rèn)知功能的影響
　　目的:通過mTORC1受體抑制劑雷帕霉素，誘導(dǎo)損傷側(cè)海馬組織自噬增強(qiáng)，觀察大鼠空間記憶功能變化。
　　材料和方法:應(yīng)用成年雄性SD大鼠中型創(chuàng)傷性腦損傷模型，方法同前。
　　雄性成年SD大鼠84只，體重(190±15g)，飼養(yǎng)3周后，體重為(350±20)g，準(zhǔn)備工作同前，84只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組:第1組（CTR+

10、DMSO組，數(shù)量=12）;第2組（CTR+Rapamycin組1.5 mg/kg，數(shù)量=13）;第3組（Sham+ DMSO組，數(shù)量=12）;第4組（Sham+ Rapamycin組1.5 mg/kg，數(shù)量=12）;第5組(TBI+DMSO組，數(shù)量=18);第6組（TBI+Rapamycin組1.5mg/kg，數(shù)量=17）。給藥方式:TBI后30min內(nèi)為首次給藥時間，后連續(xù)2周間隔24小時給藥。
　　TBI后第36～40天行Mo

11、rris水迷宮測試，方法同前。
　　結(jié)果：Morris水迷宮數(shù)據(jù)證明:大鼠TBI后，Rapmycin組比較DMSO組，潛伏期P明顯縮短（13.82s VS6.0s，P＜0.05）;DMSO組則出現(xiàn)明顯的空間記憶功能障礙（19.75s VS7.75s，P＜0.05）;而Sham組與CTR組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(6.75s VS7.5s，P＞0.05)。
　　結(jié)論：給予雷帕霉素激動自噬后，大鼠空間記憶功能得到改善。
　　第三部

12、分雷帕霉素對中型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡的影響
　　目的:通過mTORC1受體抑制劑雷帕霉素誘導(dǎo)損傷側(cè)海馬組織自噬增強(qiáng)，觀察海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡變化。
　　材料和方法:行為學(xué)測試最后一天（傷后40天），按照隨機(jī)數(shù)字表法抽取大鼠(TBI+Rapmycin)組8只，(TBI+DMSO)組9只，(Sham+Rapmycin)組6只，(Sham+DMSO)組6只，(CTR+Rapmycin)組6只，(

13、CTR+DMSO)組6只，麻醉后斷頭取損傷側(cè)海馬組織行Western-blot檢測自噬變化，方法同前;剩余大鼠則提取完整腦組織，經(jīng)4％多聚甲醛固定后經(jīng)石蠟包埋，自前囟后2.31mm至前囟后4.9mm連續(xù)冠狀切片，厚度設(shè)定為4μm。腦組織觀察區(qū)域限定為損傷同側(cè)腦組織海馬結(jié)構(gòu)(CA3)區(qū)。通過免疫組化、免疫熒光以及凋亡TUNEL觀察不同組別損傷側(cè)海馬組織CA3區(qū)損傷后期神經(jīng)細(xì)胞自噬水平及凋亡細(xì)胞數(shù)量差異。
　　結(jié)果：
　　1、W

14、estern-blot、免疫組化及免疫熒光結(jié)果提示中度TBI后6周，損傷側(cè)海馬組織自噬水平明顯下降(P＜0.01)，雷帕霉素治療組可提升損傷側(cè)海馬組織自噬水平。證明了本課題所選擇治療劑量、給藥方式及治療時間窗效果肯定;
　　2、Western-blot及免疫組化、免疫熒光、TUNEL凋亡檢測提示:(TBI+Rapmycin)組損傷側(cè)海馬組織自噬明顯增強(qiáng)，且神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制，海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目減少(P＜0.05)。