骨髓基質(zhì)細胞結(jié)合VEGF豬心內(nèi)膜注射治療慢性心肌缺血以及VEGF在心肌保護中作用的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心臟病嚴重威脅人們的健康。闡明缺血性心臟病的發(fā)病機理，尋求合理的治療措施，是當今醫(yī)學界亟待攻克的重要課題。已有研究證實干細胞移植和基因治療可能促進心梗后心肌的再生及促進新生血管生成，在一定程度上改善心功能。骨髓基質(zhì)細胞（BMSCs)自體移植技術(shù)以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的“基因搭橋技術(shù)”已被許多研究證實各自的安全性和有效性，但VEGF并不能挽救瘢痕區(qū)的心肌，對于已經(jīng)凋亡和變性的心肌細胞無法彌補或者逆轉(zhuǎn)，

2、而BMSCs移植后，雖然可以增加瘢痕區(qū)的新生心肌細胞，但缺血心肌內(nèi)缺血缺氧環(huán)境使得移植細胞的存活率較低。同時BMSCs和VEGF都具有促進血管新生的功能，將兩種治療方法聯(lián)合應用是否可以彌補兩者各自的不足，達到促進血管新生和心肌細胞再生，進一步改善心功能的目的，尚需要進一步的研究。而且，VEGF在缺血性心肌病治療研究中的作用表現(xiàn)，僅僅用促進血管新生來解釋是不夠的，是否存在額外的心肌保護作用，需要進行進一步的機制方面的研究。
　　實驗

3、目的：
　　本研究第一部分采用豬慢性心肌梗死模型，應用左室心內(nèi)膜電機械標測系統(tǒng)及NOGA注射導管，利用不同的檢測指標，觀察BMSCs結(jié)合VEGF165心內(nèi)膜心肌內(nèi)注射對心肌梗死的療效。
　　研究第二部分針對VEGF的表現(xiàn)，觀察VEGF是否存在心肌細胞的直接保護作用，并探討VEGF是否在心肌中作為SDF-1α/CXCR4軸和VEGF/VEGFR通路中的一種存活因子，通過PI3K/Akt/SDF-1α通路參與了對H2O2誘導的心

4、肌細胞死亡的保護作用。
　　實驗方法：
　　第一部分：通過建立豬心肌梗死模型，胸骨穿刺抽取骨髓，分離培養(yǎng)BMSCs，部分細胞進行VEGF165基因轉(zhuǎn)染。模型建立成功4周后，進行左室心內(nèi)膜電機械標測并行心肌膜注射等操作，按照注射成分不同分為3組，聯(lián)合組（n=8）注射轉(zhuǎn)染VEGF165基因的BMSCs，細胞組（n=8）注射BMSCs，對照組（n=6）注射生理鹽水。于細胞移植前及移植后4周分別進行左室心內(nèi)膜電機械標測、選擇性冠脈造

5、影及超聲心動圖檢查。
　　第二部分：細胞水平研究，分離新生鼠的心室肌細胞，H2O2誘導心肌細胞損傷，培養(yǎng)上清中分別加入VEGF和SDF-1α分子，收集細胞樣品，提取蛋白或mRNA，免疫印跡電泳方法檢測培養(yǎng)細胞的SDF-1α、CXCR4和Akt表達水平以及Akt磷酸化水平。利用實時定量PCR方法和ELISA方法檢測和VEGF的蛋白及mRNA表達水平，細胞活性和損傷檢測通過胎盤藍染色及LDH活性檢測進行。
　　實驗結(jié)果：

6、　　第一部分研究結(jié)果顯示：術(shù)后4周時聯(lián)合組較細胞組及對照組的心梗面積明顯縮小，側(cè)支循環(huán)、心臟泵血功能以及心肌收縮力改善更加明顯。
　　第二部分研究結(jié)果顯示：H2O2可誘導分離培養(yǎng)的心肌細胞損傷，胎盤藍染色及LDH活性測定顯示細胞培養(yǎng)上清中加入VEGF可顯著增加細胞活力，促進細胞存活。WB結(jié)果顯示Akt磷酸化水平增加，SDF-1α和CXCR4表達上調(diào)，此作用可被PI3K特異性抑制劑消除。培養(yǎng)上清中加入SDF-1α，可顯著增加心肌細胞