分娩性臂叢損傷垂腕垂指畸形發(fā)生機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、模擬產(chǎn)癱和成人臂叢根性損傷發(fā)生垂腕垂指畸形的大鼠模型建立
　　 目的：建立產(chǎn)癱和成人臂叢根性損傷出現(xiàn)垂腕垂指畸形的大鼠模型。
　　 方法：取雄性SD大鼠72只，其中出生后7天(P7)、14天(P14)和成年(大于3月齡)各24只，組成上述3個(gè)年齡組。每個(gè)年齡組大鼠按神經(jīng)根處理方式等分成3個(gè)亞組，即：切斷右側(cè)C56神經(jīng)根、C567神經(jīng)根和C5678神經(jīng)根。
　　 各組于術(shù)

2、后3個(gè)月分別行如下檢測(cè)以比較不同臂叢根性損傷對(duì)各年齡大鼠橈神經(jīng)麻痹程度的差異：1)行為學(xué)評(píng)估：以腕關(guān)節(jié)背伸小于0°為垂腕標(biāo)準(zhǔn)，比較各組大鼠垂腕垂指發(fā)生率；2)橈神經(jīng)電生理檢測(cè)：觀察前臂伸肌群CMAP潛伏期延遲率(latency delayed rate，LDR)及波幅恢復(fù)率(amplitude recovery rate，ARR)的變化，比較橈神經(jīng)病變程度；3)前臂伸肌組織學(xué)檢測(cè)：測(cè)量橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌濕重，HE染色后測(cè)量肌細(xì)胞橫截面

3、積，觀察肌濕重維持率(muscleweight maintaining rate，MWMR)和肌細(xì)胞截面積恢復(fù)率(cross-sectional arearecovery rate，CSARR)的變化，比較前臂伸肌萎縮程度。Von Geison染色觀察肌肉組織膠原纖維含量的變化，比較纖維化程度；4)橈神經(jīng)組織學(xué)檢測(cè)：取上臂中段橈神經(jīng)主干行甲苯胺藍(lán)半薄切片染色觀察有髓神經(jīng)纖維的形態(tài)及數(shù)目，比較再生有髓神經(jīng)纖維的通過(guò)率(regenerate

4、d nerve traversing rate，NTR)：5)分子生物學(xué)檢測(cè)：Real-time PCR及Western-blot檢測(cè)觀察橈神經(jīng)組織內(nèi)神經(jīng)絲蛋白200(NF200)和外周髓鞘蛋白0(PO)的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，比較橈神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維的成熟度。
　　 各組垂腕垂指發(fā)生率用Fisher精確概率法比較。其余數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布者以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，資料呈偏態(tài)分布時(shí)則以中位數(shù)(25百分位數(shù)～75百分

5、位數(shù))表示。對(duì)正態(tài)分布且滿足方差齊性的資料行方差分析，未滿足上述條件的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，Bonferroni法控制檢驗(yàn)水平。數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：1)行為學(xué)觀察：C56神經(jīng)根切斷后，各年齡組大鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)均無(wú)垂腕垂指畸形。C567切斷后，成年組8只大鼠中僅有1例而P7和P14組分別為7例和6例發(fā)生垂腕垂指。成年組垂腕垂指畸形發(fā)生率低于P7組(P<0.05)

6、和P14組(P>0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P7組和P14組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C5678切斷后，各年齡組大鼠每例實(shí)驗(yàn)側(cè)均出現(xiàn)垂腕垂指畸形。
　　 2)橈神經(jīng)電生理檢測(cè)：C56神經(jīng)根切斷后，各年齡組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌所有電生理指標(biāo)總體比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。C567神經(jīng)根切斷后，各年齡組橈側(cè)腕伸肌及指總伸肌CMAP潛伏期延遲率總體比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。成年組橈

7、側(cè)腕伸肌和指總伸肌CMAP波幅恢復(fù)率高于P7組(P值均小于0.05)和P14組(P值均小于0.05)，P7組和P14組比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。C5678神經(jīng)根切斷后，各年齡組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌所有電生理指標(biāo)總體比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)
　　 3)前臂伸肌群組織學(xué)檢測(cè)：C56神經(jīng)根切斷后，各年齡組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌肌濕重維持率、肌細(xì)胞截面積恢復(fù)率及膠原纖維累積光密度比值總體比較的差異均

8、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。C567神經(jīng)根切斷后，成年組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌肌濕重維持率高于P7組(P值均小于0.05)和P14組(P值均小于0.05)，P7組和P14組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。成年組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌肌細(xì)胞截面積恢復(fù)率高于P7組(P值均小于0.05)和P14組(P值均小于0.05)，P7組和P14組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。成年組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌膠原纖維累積光密度比值均低于P

9、7組和P14組(P值均小于0.05)，P7組和P14組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。C5678損傷術(shù)后，各年齡組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌肌濕重維持率、肌細(xì)胞截面積恢復(fù)率及膠原纖維累積光密度比值總體比較的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。
　　 4)橈神經(jīng)組織學(xué)檢測(cè)：C56神經(jīng)根切斷后，各年齡組橈神經(jīng)再生有髓神經(jīng)纖維的通過(guò)率總體比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。C567神經(jīng)根切斷后，成年組橈神經(jīng)再生有髓神

10、經(jīng)纖維的通過(guò)率高于P7組和P14組(P值均小于0.05)，P7組和P14組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。C5678神經(jīng)根切斷后，各年齡組橈神經(jīng)再生有髓神經(jīng)纖維的通過(guò)率總體比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。
　　 5)分子生物學(xué)檢測(cè)：C56神經(jīng)根切斷后，各年齡組測(cè)得NF200和P0蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白含量總體比較的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。C567神經(jīng)根切斷后，成年組NF200和P0

11、蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白含量均高于P7組(P值均小于0.05)和P14組(P值均小于0.05)，P7組和P14組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。C5678神經(jīng)根切斷后，各年齡組測(cè)得NF200和P0蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白含量總體比較的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。
　　 結(jié)論：上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：C56神經(jīng)根切斷后幼年和成年大鼠伸腕伸指功能均無(wú)明顯損害；C567神經(jīng)根切斷后幼年大鼠伸腕伸指功能損害明

12、顯加重，成年大鼠損傷程度較輕而不足以引起明顯伸腕伸指功能障礙。C5678神經(jīng)根切斷后，所有檢測(cè)指標(biāo)均表明不論幼年大鼠還是成年大鼠伸腕伸指功能均嚴(yán)重受損。
　　 本實(shí)驗(yàn)證明幼年及成年大鼠臂叢根性損傷造成垂腕垂指畸形的規(guī)律與人類相似，因此大鼠是進(jìn)行產(chǎn)癱與成人臂叢根性損傷垂腕垂指畸形發(fā)生機(jī)制研究的理想動(dòng)物。
　　 第二部分、不同年齡大鼠臂叢根性損傷導(dǎo)致垂腕垂指畸形發(fā)生機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：通過(guò)逆行示蹤技術(shù)測(cè)定大鼠

13、橈神經(jīng)相應(yīng)脊髓前角細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，比較新生及成年大鼠橈神經(jīng)運(yùn)動(dòng)成分的神經(jīng)根支配百分比，以及隨年齡增長(zhǎng)的變化規(guī)律，闡明幼年和成年大鼠臂叢根性損傷導(dǎo)致垂腕垂指畸形的發(fā)生機(jī)制。
　　 方法：取雄性SD大鼠24只，其中出生后7天(P7)、14天(P14)和成年(大于2月齡)大鼠各8只，組成上述3個(gè)年齡組。以5％霍亂毒素亞單位B(cholera toxin Bsubmit，CTB)為示蹤劑，經(jīng)橈神經(jīng)逆行標(biāo)記C5678T1節(jié)段脊髓前角運(yùn)動(dòng)

14、神經(jīng)元后作30μm連續(xù)冰凍切片，漂片法免疫熒光顯色后用Abercrombie公式校正計(jì)數(shù)，觀察臂叢上(C56)、中(C7)、下干(C8T1)脊髓節(jié)段標(biāo)記的前角細(xì)胞在所有標(biāo)記神經(jīng)元中所占百分比隨年齡增長(zhǎng)的變化規(guī)律。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布者以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，資料呈偏態(tài)分布時(shí)則以中位數(shù)(25百分位數(shù)-75百分位數(shù))表示。對(duì)正態(tài)分布且滿足方差齊性的資料行方差分析，未滿足上述條件的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為顯著

15、性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，Bonferroni法控制檢驗(yàn)水平。數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：比較標(biāo)記細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)：P7組大鼠標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)目為326.3±36.9；P14組大鼠為212.8±20.6；成年大鼠為140.4±19.5，三者之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P7和P14組比較P<0.0001；P7和成年組比較P<0.0001；P成年組和P14組比較P<0.0001)。
　　 在C5和C6節(jié)段，P7組

16、標(biāo)記神經(jīng)元所占比例為34.2%、P14組為31.3%、成年組為24.8%。三組數(shù)據(jù)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各年齡組C56節(jié)段細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比值兩兩比較：P7組高于成年組(P<0.05)；P14組高于成年組(P<0.05)；P7組和P14組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 在C7節(jié)段，P7組標(biāo)記神經(jīng)元所占比例為28.4%、P14組為25.3%、成年組為22.5%。三組數(shù)據(jù)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

17、5)。P7組高于成年組(P<0.05)；P14組和成年組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；P7組和P14組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 在C8和T1節(jié)段，P7組標(biāo)記神經(jīng)元所占比例為37.5%、P14組為44.7%、成年組為50.7%。三組數(shù)據(jù)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各年齡組C8T1節(jié)段細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比值兩兩比較：P7組低于成年組(P<0.05)；P14組低于成年組(P<0.05)；P7組和P14組差異

18、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：臂叢上、中、下干對(duì)大鼠橈神經(jīng)運(yùn)動(dòng)成分的支配權(quán)重隨著年齡變化有“重心下移”的趨勢(shì)，即在幼年大鼠橈神經(jīng)運(yùn)動(dòng)成分較多來(lái)源于上、中干，而下干支配比率相對(duì)較小。隨著年齡增長(zhǎng)下干支配比例逐漸升高，最終導(dǎo)致來(lái)源于上、中干及來(lái)源于下干的橈神經(jīng)支配權(quán)重接近。神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，脊髓各節(jié)段之間支配橈神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分布比例的動(dòng)態(tài)改變可能是造成大鼠臂叢上、中干損傷后幼年較成年個(gè)體更容易出現(xiàn)垂腕垂指畸形的主要原因

19、。
　　 第三部分、不同神經(jīng)重建手術(shù)對(duì)各年齡段大鼠臂叢根性損傷垂腕垂指畸形療效的比較研究
　　 目的：觀察不同神經(jīng)重建手術(shù)對(duì)新生大鼠和成年大鼠臂叢上、中干損傷垂腕垂指畸形療效的影響，為臨床上手術(shù)方式選擇提供理論依據(jù)。
　　 方法：取雄性SD大鼠48只，其中出生后7天(P7)和成年(出生后90-100天，體重200-250g)大鼠各24只，組成上述2個(gè)年齡組。切斷左側(cè)臂叢上、中干后立即行不同修復(fù)術(shù)，每組按手術(shù)方式等

20、分為3個(gè)亞組：A)神經(jīng)移植修復(fù)上、中干；B)神經(jīng)移植修復(fù)上千，中干不予修復(fù)，遠(yuǎn)端反折縫合于鄰近肌肉；C)上、中干不予修復(fù)，遠(yuǎn)端反折縫合于鄰近肌肉。
　　 各亞組于術(shù)后3月分別行如下檢測(cè)分別比較不同術(shù)式對(duì)各年齡組前臂伸腕伸指功能改善情況：1)行為學(xué)評(píng)估：以腕關(guān)節(jié)背伸小于0°為垂腕標(biāo)準(zhǔn)，比較各組大鼠垂腕垂指發(fā)生率；2)橈神經(jīng)電生理檢測(cè)：觀察前臂伸肌群CMAP潛伏期延遲率(latency delayed rate，LDR)及波幅恢復(fù)率

21、(amplitude recovery rate，ARR)的變化，比較橈神經(jīng)傳導(dǎo)性能及前臂伸肌興奮性；3)前臂伸肌組織學(xué)檢測(cè)：測(cè)量橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌濕重，HE染色后測(cè)量肌細(xì)胞橫截面積，觀察肌濕重維持率(muscle weight maintaining rate，MWMR)和肌細(xì)胞截面積恢復(fù)率(cross-sectional area recovery rate，CSARR)的變化，比較前臂伸肌萎縮程度。4)橈神經(jīng)組織學(xué)檢測(cè)：取橈神經(jīng)

22、行甲苯胺藍(lán)半薄切片染色觀察有髓神經(jīng)纖維的形態(tài)及數(shù)目，比較再生有髓神經(jīng)纖維的通過(guò)率(regenerated nerve traversing rate，NTR)；5)分子生物學(xué)檢測(cè)：Real-time PCR及Western-blot檢測(cè)觀察橈神經(jīng)組織內(nèi)神經(jīng)絲蛋白200(NF200)和外周髓鞘蛋白0(P0)的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，比較有髓神經(jīng)纖維的成熟度。統(tǒng)計(jì)方法同第一部分。
　　 結(jié)果：1)行為學(xué)觀察：幼年和成年大鼠A組

23、均無(wú)垂腕垂指；幼年B組大鼠垂腕垂指發(fā)生率高于成年B組(P<0.05)；幼年C組垂腕垂指發(fā)生率高于成年C組(P<0.05)。幼年大鼠A組垂腕垂指少于幼年B組(P<0.05)和C組(P<0.05)，B、C兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；成年大鼠A、B兩組間垂腕垂指發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均少于C組(P<0.05)。
　　 2)橈神經(jīng)電生理檢測(cè)：幼年各組比較，橈側(cè)腕伸肌及指總伸肌CMAP潛伏期延遲率總體比較的

24、差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)；A、B、C三組橈側(cè)腕伸肌及指總伸肌CMAP波幅恢復(fù)率均依次降低，兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05)。成年各組比較，A、B、C三組橈側(cè)腕伸肌及指總伸肌CMAP潛伏期延遲率總體比較的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。A、B兩組橈側(cè)腕伸肌及指總伸肌CMAP波幅恢復(fù)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)，但均高于C組(P值均小于0.05)。
　　 3)前臂伸肌群組織學(xué)檢

25、測(cè)：幼年A、B、C組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌肌濕重維持率依次降低，兩兩比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05)。肌細(xì)胞截面積恢復(fù)率依次降低，兩兩比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05)。成年A、B兩組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌肌濕重維持率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)，但均高于C組(P值均小于0.05)。A、B兩組橈側(cè)腕伸肌和指總伸肌肌細(xì)胞截面積恢復(fù)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)，但均高于C組(P值均小于0.05

26、)。
　　 4)橈神經(jīng)組織學(xué)檢測(cè)：幼年A、B、C三組再生有髓神經(jīng)纖維的通過(guò)率依次減小，兩兩比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05)。成年A、B兩組間再生有髓神經(jīng)纖維通過(guò)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)，但均高于C組(P值均小于0.05)。
　　 5)分子生物學(xué)檢測(cè)：幼年A、B、C三組MyoD1和Myogenin的mRNA相對(duì)含量均依次升高，兩兩比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05)。成年A、B組M

27、yoD1和Myogenin的mRNA相對(duì)含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)，但均高于C組(P值均小于0.05)。幼年A、B、C三組MyoD1和Myogenin與B-actin的吸光度比值均依次升高，兩兩比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05)。成年A、B組MyoD1和Myogenin與β-actin的吸光度比值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)，但均高于C組(P值均小于0.05)。
　　 結(jié)論：成年大鼠單純