Twist在肺癌中高表達(dá)并與肺癌的分化有關(guān).pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子Twist是上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)過程中的重要調(diào)控因子，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。上皮間質(zhì)化是腫瘤進(jìn)展的重要過程，Twist被認(rèn)為通過調(diào)節(jié)E—cadherin的表達(dá)通過EMT途徑調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而Twist在腫瘤進(jìn)展中的具體作用仍不清。本研究采用肺癌組織標(biāo)本，檢測(cè)Twist在肺癌組織中的表達(dá)水平，及其與臨床病理因素的關(guān)系，同時(shí)檢測(cè)Twist蛋白和Twist1、Twist2的mRNA在多種肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，深入研究Twist

2、與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 材料和方法: 一、病例和材料 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2000年11月至2006年4月間手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的68例肺腺癌和肺鱗癌標(biāo)本，其中男性40例，女性28例，患者平均年齡59歲；所有病例術(shù)前均未接受過放化療及免疫治療，取例癌旁正常肺組織作為對(duì)照。細(xì)胞系用含15％胎牛血清的RPMI—1640培養(yǎng)基，其它細(xì)胞都用含10％FBS的RPMI—1640培養(yǎng)基，pH值保持在7.2～7.4之間

3、，于含5％ CO2的37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。 二、試劑 Twist兔抗人多克隆抗體Twist(H—81)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司，SP超敏免疫組織化學(xué)試劑盒(KIT—9710)和DAB顯色試劑盒(DAB-0031)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver．3.0購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司，RPM

4、I—1640購(gòu)自GIBCO公司。 三、方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)肺癌組織及癌旁正常肺組織中Twist的表達(dá)。染色方法按SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行，經(jīng)檸檬酸(pH=6.0)微波抗原修復(fù)。每張切片在光學(xué)顯微鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)其中的陽性細(xì)胞數(shù)，然后取平均值。染色強(qiáng)度分級(jí)為：陰性為0，淡黃色為1，黃棕色為2，深棕色為3。以陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)分級(jí)：<5％為0.5％～25％為1，2

5、5％～50％為2，>50％為3。利用染色強(qiáng)度與陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)乘積來評(píng)定結(jié)果，0為陰性，1為弱陽性，2～4為陽性，6～9為強(qiáng)陽性。電泳成像后進(jìn)行分析光密度值。將Twist1、Twist2的光密度值與GAPDH光密度值的比值作為Twist1、Twist2的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較分析。 四、統(tǒng)計(jì)分析方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS for Windows13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，對(duì)Twist的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系采用兩組資料非

6、參數(shù)檢驗(yàn)和多組資料非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，Twist在細(xì)胞系中的表達(dá)采用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、免疫組化 68例肺鱗癌和腺癌組織中，有8例為Twist陰性(11.76％)，9例為Twist弱表達(dá)(13.24％)，28例Twist表達(dá)(41.18％)，有23例Twist高表達(dá)(33.82％)(圖1)。Twist在8例癌旁肺組織中弱表達(dá)。Twist的表達(dá)情況與肺癌的分化程度(P=0.002)和

7、肺癌患者的年齡(P=0.012)相關(guān)。Twist的表達(dá)水平與患者的性別(P=0.820)、組織學(xué)類型(P=0.426)、TNM分期(P=0.200)和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.392)關(guān)系并不顯著。 二、RT-PCR Twist1和Twist2的mRNA在HBE和8種肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)并不一致(圖2)。Twist1在HBE表達(dá)，在不同組織學(xué)類型的癌細(xì)胞系之間比較，Twist1在在肺腺癌A549表達(dá)最高，在肺鱗癌SK細(xì)胞系中

8、表達(dá)較A549少；在肺大細(xì)胞癌460和661和肺巨細(xì)胞癌LH7和BE1細(xì)胞系中的表達(dá)水平基本相同，表達(dá)水平較低；在肺小細(xì)胞癌446細(xì)胞系中表達(dá)水平較A549低。Twist2在HBE表達(dá)，但較Twist1表達(dá)水平低，在不同組織學(xué)類型的癌細(xì)胞系之間比較，Twist2在肺鱗癌細(xì)胞系SK中表達(dá)較高，肺腺癌A549和LTE中表達(dá)較SK少；在肺大細(xì)胞癌460和661和肺巨細(xì)胞癌LH7和BE1細(xì)胞系中的表達(dá)水平基本相同，表達(dá)水平較低；在肺小細(xì)胞癌44

9、6細(xì)胞系中表達(dá)水平較高。其次在同種組織學(xué)類型的不同細(xì)胞系中比較，Twist2 mRNA在A549的表達(dá)低于LTE；在460、661兩種細(xì)胞系中表達(dá)水平也較為一致；在LH7和BE1細(xì)胞系表達(dá)水平也無明顯差別。 三、免疫熒光 在人支氣管上皮HBE細(xì)胞系中，Twist弱表達(dá)，Twist蛋白在不同肺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平不同(圖3～圖8)，在肺腺癌LTE和A549細(xì)胞系和肺鱗癌SK中表達(dá)較強(qiáng)，大細(xì)胞癌460和661熒光強(qiáng)度比腺癌和鱗

10、癌弱，Twist蛋白表達(dá)定位以細(xì)胞漿為主。 結(jié)論: 在癌旁肺組織中Twist弱表達(dá)，肺鱗癌和肺腺癌組織中Twist較高表達(dá)。Twist的表達(dá)情況與肺癌的分化程度相關(guān)，低分化的肺癌Twist高表達(dá)，中高分化的肺癌其陽性表達(dá)，這表明Twist可能在肺癌發(fā)生中起重要作用。Twist的mRNA表達(dá)在肺鱗癌和腺癌細(xì)胞系中均高于HBE。在蛋白水平，Twist的表達(dá)在肺鱗癌和腺癌細(xì)胞系中均高于HBE，表達(dá)于細(xì)胞漿。我們的研究提示Twi