促進rAAV在肺癌細胞中高表達的miRNA篩選及機制初探.pdf

1、研究背景
　　近年來,基因治療取得長足的進展,全世界已有上千例基因治療研究進入臨床試驗,治療的范圍已從遺傳病領(lǐng)域擴展到癌癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、傳染病(包括AIDS)等領(lǐng)域。然而,呈遞基因藥物的載體的局限性阻礙了基因治療的發(fā)展。
　　rAAV(Recombinant Adeno-associated Virus)基因藥物載體這一后起之秀格外引人注目,腺相關(guān)病毒屬于細小病毒家族,具有宿主范圍廣、非致病性、能長期穩(wěn)定表達外

2、源基因等優(yōu)點,被認為是最有前景的基因治療載體之一。
　　一些臨床研究的問題如血友病基因治療中AAV2外殼啟動了CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),對肝細胞產(chǎn)生細胞毒性,缺陷、帕金森病的臨床試驗被證明基本無效,對rAAV載體的表達效率提出了更高要求。
　　一些治療基因,在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時,還可提高載體的表達效率。2009年Johnson等研究發(fā)現(xiàn),siRNA介導(dǎo)的沉默機制使rAAV載體的表達效率最高可提高15倍和30倍。2011

3、年Wallen等從5520個siRNA文庫中篩選出50個能提高rAAV表達至8倍的siRNA。
　　以上研究為本論文提供了良好的借鑒。miRNA是一類長約22nt的小片段RNA分子,能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。它的異常表達與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切,尤其是在肺癌中的影響,引起強烈關(guān)注,并得到大量研究。
　　研究目的
　　本論文將探索miRNA在以rAAV作為載體的基因治療中的作用,在小細胞肺癌細胞NCI-H446細胞系中高通

4、量篩選miRNA文庫以發(fā)現(xiàn)促進rAAV表達的miRNA序列并利用生物信息學(xué)軟件對明星 miRNA進行靶點和信號通路預(yù)測,探索其作用機理,為rAAV-miRNA的基因藥物的研究打開一扇門。
　　研究方法
　　(1)細胞培養(yǎng),建立NCI-H446細胞系;
　　(2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染EGFP siRNA和EGFP質(zhì)粒以評估和建立良好的轉(zhuǎn)染體系;
　　(3)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染包含近2000條序列的miRNA文庫;

5、　　(4)轉(zhuǎn)染rAAV-GLUC病毒,以GLUC熒光表達量來衡量rAAV的表達水平;
　　(5)用腔腸素(coelenterazine)配制工作液來檢測GLUC熒光強度;
　　(6) MTT法檢測轉(zhuǎn)染體系中細胞增殖及活力;
　　(7)用穩(wěn)健型Z評分,四分位法等統(tǒng)計學(xué)算法對篩選數(shù)據(jù)進行科學(xué)的統(tǒng)計和結(jié)果鑒定,挑選出可以提高rAAV轉(zhuǎn)染效率的miRNA;
　　(8)使用生物信息學(xué)軟件如Targetscan,Pictar