LPK基因在非酒精性脂肪肝中的表觀遺傳學(xué)研究.pdf

1、非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)嚴(yán)重危害人類健康。丙酮酸激酶基因(L-type pyruvate kinase，LPK)是糖酵解通路中的關(guān)鍵基因之一，多個(gè)關(guān)聯(lián)研究結(jié)果都顯示LPK基因和非酒精性脂肪肝的發(fā)生有顯著相關(guān)性，為此，我們?cè)贜AFLD模型中開(kāi)展了LPK基因表觀遺傳學(xué)研究。
　　首先，通過(guò)棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)大鼠肝臟細(xì)胞(BRL)制備了N

2、AFLD細(xì)胞模型，通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠建立了NAFLD大鼠模型。在兩種NAFLD模型中LPK基因的mRNA和酶活性都顯著下降(P＜0.01)，LPK蛋白表達(dá)量在BRL細(xì)胞模型中也有明顯下調(diào)。在人肝細(xì)胞(QSG7701)中過(guò)量表達(dá)LPK基因，可顯著提高細(xì)胞增殖速率(P＜0.05)、加快葡萄糖消耗速度(P＜0.01)、增強(qiáng)細(xì)胞甘油三酯代謝速率(P＜0.01);抑制LPK基因表達(dá)后，上述指標(biāo)均顯著下降，顯示LPK基因?qū)τ诩?xì)胞增殖、糖脂代謝

3、具有重要的調(diào)控作用。鹽酸小檗堿(Breberine，BBR)對(duì)NAFLD細(xì)胞和動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)后，均可以顯著提高LPK基因的表達(dá)和酶活性(P＜0.01)。
　　在此基礎(chǔ)上，該論文從DNA甲基化，組蛋白乙?；蚼iRNA調(diào)控三方面研究NAFLD模型中表觀遺傳學(xué)修飾對(duì)LPK基因表達(dá)的影響:
　　1.NAFLD大鼠和細(xì)胞模型中LPK基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化程度顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。熒光素酶(Luc)報(bào)告系統(tǒng)表

4、明LPK基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度升高會(huì)顯著降低(P＜0.01)LPK基因啟動(dòng)子活性。高效液相色譜(HPLC)實(shí)驗(yàn)顯示:兩種NAFLD模型的基因組DNA整體甲基化水平均顯著降低(P＜0.01)。定量PCR結(jié)果顯示DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表達(dá)量在兩種NAFLD模型中均顯著降低(P＜0.05)。BBR藥物干預(yù)可以顯著降低(P＜0.05)LPK基因啟動(dòng)子區(qū)域各CpG位點(diǎn)的甲基化程度;提高部分DNA甲基轉(zhuǎn)移

5、酶Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表達(dá)量，從而升高基因組DNA的整體甲基化水平(P＜0.05)。
　　2.染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChiP)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種NAFLD模型中LPK基因DNA區(qū)域組蛋白H3、H4的總體乙?；潭染@著低于對(duì)照組(P＜0.01)。BBR藥物干預(yù)可以選擇性降低LPK基因DNA區(qū)域組蛋白H3、H4的總體乙酰化程度(P＜0.05)。NAFLD大鼠

6、模型中LPK轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ChREBP與LPK啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合量減少(P＜0.01)。
　　3.microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測(cè)LPK3'-UTR區(qū)域存在miR-15b作用序列。定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-15b表達(dá)量在NAFLD細(xì)胞和動(dòng)物模型中都顯著升高(P＜0.01)。在QSG7701細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-15b會(huì)顯著降低LPK的mRNA表達(dá)量(P＜0.01)、降低細(xì)胞增殖速率(P＜0.01)、減少葡萄糖消耗量(P＜0.05)，減慢

7、甘油三酯的代謝速度(P＜0.05)。Luc報(bào)告系統(tǒng)顯示miR-15b可以顯著降LPK3'-UTR的活性，說(shuō)明miRNA-15b能夠抑制LPK酶的表達(dá)。此外，在我們收集的37例健康人和64例脂肪肝患者的血清的miRNA定量檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)脂肪肝患者血清中miR-15b的表達(dá)量顯著高于(P＜0.01)健康人。這提示miR-15b可能是潛在的血清標(biāo)志物
　　綜上所述，本課題從表觀遺傳學(xué)的三個(gè)方面:DNA甲基化、組蛋白乙?；蚼iRNA調(diào)控初