葡萄糖激酶激活劑的發(fā)現(xiàn)及LGK-01抗糖尿病作用研究和機制的初步探討.pdf

1、葡萄糖激酶(GK)是一種存在于哺乳動物肝臟和胰腺中分子量為50KDa的蛋白質(zhì)，也被稱為Ⅳ型己糖激酶，是糖酵解過程中的第一個限速酶。GK具有雙重作用，肝臟中的GK參與葡萄糖磷酸化，加速糖原合成及葡萄糖代謝；胰腺中的GK為葡萄糖敏感器，促進高濃度葡萄糖狀態(tài)下胰島β細胞分泌胰島素。GK功能異常將直接導致糖代謝紊亂，造成糖耐量異常及胰島功能低下。實驗證明，GK活性增加可促進葡萄糖的磷酸化，促進糖原合成和胰島素釋放，從而改善糖耐量異常，提高胰島細

2、胞功能，改善糖尿病癥狀。葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白(GKRP)是一種僅存在于哺乳動物肝臟中分子量為68KDa的蛋白質(zhì)，是GK的內(nèi)源性抑制物，可與GK形成復合物而使GK失去活性。因此，GK和GKRP已逐步成為治療糖尿病的新靶點之一，針對于該靶點的小分子GK激活劑及GKRP解離劑的尋找已經(jīng)成為國內(nèi)外研發(fā)治療2型糖尿病藥物的新熱點。 本文從人肝臟組織中克隆得到長度為1.4kb的人源肝臟GK蛋白編碼區(qū)的cDNA，連接畢赤酵母(Pichiapas

3、toris)表達載體pPIC9K，以重組載體pPIC9K-GK轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。經(jīng)過培養(yǎng)條件的摸索和發(fā)酵液的初步處理純化，獲得了重組人GK蛋白。對該重組蛋白進行活性測定后，證實其具有與天然GK蛋白一致的活性。經(jīng)過對底物濃度、酶用量等一些因素的摸索和優(yōu)化，利用重組人GK蛋白建立了GK激活劑篩選方法。同時，又從人肝臟中克隆得到長度為1878bp的人源肝臟GKRP蛋白編碼區(qū)的cDNA，連接大腸桿菌(E.coli)表達載體pET32a(+

4、)，以重組載體pET32a-GKRP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21trx(DE3)，獲得了重組人GKRP蛋白。除此之外，還將人GKRP蛋白編碼區(qū)的cDNA連接畢赤酵母表達載體pPIC9K，以重組載體pPIC9K-GKRP轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，同樣獲得了重組人GKRP蛋白。這些具有活性的蛋白經(jīng)過處理后，可用于小分子GK激活劑對GKRP抑制作用的研究。 利用GK激活劑篩選方法，對定向合成和非定向合成化合物進行篩選，發(fā)現(xiàn)定向合成化合物LGK-

5、01具有較強的GK激活活性。對LGK-01進行了酶學水平、細胞水平、動物整體水平及基因水平等多項研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1、LGK-01可增加葡萄糖磷酸化最大反應速率，降低底物葡萄糖的親和性，降低GKRP對GK的抑制作用。2、LGK-01可增加HepG2細胞和3T3-L1細胞的葡萄糖消耗，促進NIT-1β細胞的葡萄糖刺激的胰島素的釋放。3、LGK-01可促進HepG2細胞中GK蛋白由細胞核向細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移。4、LGK-01可改善肥胖性MSG小鼠糖

6、耐量異常。5、LGK-01可改善高脂誘導C57BL/6J小鼠的糖耐量異常和胰島素抵抗，降低空腹血糖，抑制糖異生。6、LGK-01可增加高脂誘導C57BL/6J小鼠的胰島素Ⅰ相分泌，促進肝糖原合成，增加肝臟GK活性。7、LGK-01可改善自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠糖耐量異常和胰島素抵抗，降低空腹血糖。8、LGK-01有輕微的PPARγ激活作用。 結(jié)論：1、利用異源表達獲得具有活性的人源重組GK及GKRP蛋白。2、初步建立起GK激