外周型苯二氮卓類受體配體對(duì)大腸癌細(xì)胞抑制機(jī)制以及PBR、Cyclin E和p27kip1在大腸癌中表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　 苯二氮卓家族包括一組抗焦慮和抗驚厥的藥物。最初被認(rèn)為是調(diào)節(jié)GABA控制的陰離子通道,并與中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA受體緊密聯(lián)系的配體。1977年,第二種類型的苯二氮卓受體即外周型苯二氮卓類受體(PBR)被發(fā)現(xiàn)。兩類苯二氮卓因此被明確:一類與中樞苯二氮卓受體具有高親和力而與PBR的親和力較弱;另一類與PBR之間有毫微摩爾級(jí)的親和性,并不具有抗焦慮和抗驚厥活性。最近,關(guān)于PBR配體抗腫瘤活性的研究表明、PBR定位于線粒體外膜

2、上,屬于在控制凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用的多蛋白復(fù)合體,即滲透轉(zhuǎn)換孔道蛋白(PTP)。
　　 PBR在類固醇生成組織中含量豐富,在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、結(jié)腸腺癌、結(jié)直腸癌、食道癌、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤中高表達(dá)。當(dāng)針對(duì)PBR受體的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí),其功能和效應(yīng)物反應(yīng)機(jī)制還沒有被闡述清楚?，F(xiàn)已經(jīng)清楚的PBR蛋白的功能是其與類固醇具有高度親和性,然而其尚有可能涉及其它生物學(xué)功能,如類固醇的生物合成、線粒體氧化磷酸化以及細(xì)胞增殖。在人星狀細(xì)胞瘤,

3、PBR的表達(dá)與腫瘤惡性程度和增殖率相關(guān);在人乳腺癌細(xì)胞系,PBR的表達(dá)和線粒體密度與細(xì)胞的高有絲分裂活性相關(guān)。另外,近來(lái)的研究顯示PBR在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用,在體內(nèi)和體外受體與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲性相關(guān)。
　　 利用特異性外源性PBR配體,PBR可以作為新的抗癌靶位。特異性外源性PBR配體-PK11195,顯示與PBR具有高親和性,可以抑制許多皮膚、結(jié)腸、食管、乳腺和腦等部位腫瘤的生長(zhǎng)。有胃腸癌癥,PBR配體抗

4、增殖效力被認(rèn)為是由于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯所致,其機(jī)制仍然在研究之中。近來(lái),數(shù)個(gè)涉及PBR配體誘導(dǎo)G1期阻滯的信號(hào)分子已經(jīng)被明確,在結(jié)直腸癌、食管癌、肝癌細(xì)胞中,其直接可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。研究結(jié)果顯示特異性PBR配體還具有非直接抗癌效果,這說(shuō)明它可以增強(qiáng)其它細(xì)胞穩(wěn)定藥物的抗凋亡作用。
　　 我們的研究主要是為了明確:外周苯二氮卓類受體的特異性配體-PK11195對(duì)大腸癌細(xì)胞株LS174-T生長(zhǎng)的影響,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、PBR以

5、及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子表達(dá)的作用,試圖揭示PBR、p27kip1和Cyclin E之間的關(guān)系;為了進(jìn)一步預(yù)測(cè)這一類藥物治療大腸癌的可能性和重要性,我們對(duì)大腸癌手術(shù)標(biāo)本的p27kip1和Cyclin E蛋白以及PBR、p27kip1和Cyclin E的mR-NA表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè);同時(shí),并將其與臨床資料和預(yù)后相聯(lián)系,期望能夠明晰因子之間、以及因子與臨床預(yù)后之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法):觀察

6、PK11195作用下的LS174-T細(xì)胞的增殖情況。
　　 2.流式細(xì)胞儀DNA含量分析:觀察PK11195作用下的LS174-T細(xì)胞各周期的變化情況。
　　 3.RT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn):觀察PK11195作用后,LS174-T細(xì)胞中PBR、p27kip1和Cyclin E轉(zhuǎn)錄的情況和蛋白表達(dá)的變化。
　　 4.收集術(shù)后的85例大腸癌病人的臨床以及生存資料。連同15例正常結(jié)直腸組織標(biāo)本

7、的石臘包埋組織進(jìn)行常規(guī)切片和免疫組化染色,檢測(cè)p27kip1和Cyclin E蛋白的表達(dá)。
　　 5.收集40例大腸癌病人的癌組織。連同10例正常結(jié)直腸粘膜組織新鮮冰凍標(biāo)本用來(lái)進(jìn)行p27kip1和Cyclin E蛋白的Western-blot檢測(cè),和PBR、p27kip1和Cyelin E mRNA的RT-PCR檢測(cè)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS for windows13.0軟件包分析數(shù)據(jù)。PK11195對(duì)人結(jié)

8、腸腺癌細(xì)胞LS174-T的增殖抑制作用及細(xì)胞周期影響結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析Dunnett t檢驗(yàn);Crosstabs用來(lái)進(jìn)行組間x2檢驗(yàn);PBR、p27kip1和Cyelin E表達(dá)在大腸癌各臨床參數(shù)之間的相關(guān)性通過(guò)Spearman和Pearson雙重檢驗(yàn);Log-rank和Breslow法雙重比較兩組間的生存率有無(wú)差異;Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型用來(lái)對(duì)影響生存預(yù)后的聯(lián)合效應(yīng)進(jìn)行多因素分析。
　　 結(jié)果：<

9、br>　　 1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著PK11195濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),LS174-T細(xì)胞的增殖抑制越來(lái)越明顯,表現(xiàn)出良好的時(shí)間依賴性和劑量依賴性。
　　 2.流式細(xì)胞儀DNA含量分析結(jié)果顯示,L5174-T細(xì)胞經(jīng)PK11195作用后細(xì)胞周期發(fā)生了G0/G1期阻滯,隨著藥物濃度的增加,G0/G1。期的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,細(xì)胞凋亡率增高。
　　 3.RT-PCR半定量分析結(jié)果顯示,隨著PK11195濃度的增加,P

10、BR和Cyclin E mRNA表達(dá)的量逐漸下降,p27 kip1 mRNA表達(dá)的量逐漸升高。
　　 4.Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著PK11195濃度的增加,Cyclin E蛋白表達(dá)的量逐漸下降,p27kip1蛋白表達(dá)的量逐漸升高。
　　 5.免疫組化染色結(jié)果顯示,p27kip1和Cyclin E在正常腸粘膜以及大腸癌組織中的表達(dá)率差異有非常顯著性;腫瘤突破漿膜層、臟器轉(zhuǎn)移、組織類型在中低分化、淋

11、巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及Dukes分期在C和D期情況下,Cyclin E表達(dá)率增高;腫瘤浸潤(rùn)漿膜層、組織類型在中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臟器轉(zhuǎn)移、Dukes分期在C和D期情況下,p27kip1表達(dá)率減低;Cyclin E和p27kip1之間具有負(fù)相關(guān);Cyclin E陰性和p27kip1陽(yáng)性病人的5年生存率明顯增加,p27kip1和Cyclin E陽(yáng)性與陰性病人的生存率差異有顯著性。進(jìn)入Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型的預(yù)后因素根據(jù)相對(duì)危險(xiǎn)度依次是:腫瘤浸潤(rùn)漿膜層與

12、否、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、p27kip1和Cyclin E。
　　 6.新鮮冰凍標(biāo)本W(wǎng)estern-blot檢測(cè)的結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果相近;RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果:PBR、p27kip1與cyclin E的mRNA表達(dá)在正常大腸組織中的表達(dá)率分別為50％、90％和40％;在大腸癌組織中的表達(dá)率分別為90％、48％和58％。PBR與的p27kip1 mRNA在正常大腸組織和大腸癌中的表達(dá)差異具有顯著性,而cyclin E的表達(dá)差

13、異不具有顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1.PBR特異性抑制劑PK11195對(duì)大腸癌細(xì)胞LS174-T具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用。
　　 2.PK11195可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制LS174-T細(xì)胞PBR和Cyclin E的表達(dá),促進(jìn)p27kip1的表達(dá)。在蛋白水平抑制LS174-T細(xì)胞Cyclin E的表達(dá),促進(jìn)p27kip1的表達(dá)。
　　 3.PBR和Cyclin E在大腸癌組織中高表達(dá),p27kip1在大