ROS介導(dǎo)的以Nrf2為核心的抗氧化防御體系對(duì)肺纖維化的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、肺纖維化是一種慢性炎癥間質(zhì)性疾病，其特征是肺泡區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變伴隨過(guò)度的膠原沉積。肺纖維化的病因還未完全清楚，已有大量證據(jù)表明，活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）在不同形式的肺損傷過(guò)程中扮演了重要角色，除了刺激炎癥反應(yīng)的發(fā)生外，更重要的是大量ROS的爆發(fā)破壞了體內(nèi)氧化-抗氧化的平衡，使機(jī)體失去正常的調(diào)節(jié)功能，從而對(duì)正常細(xì)胞及組織造成損傷并引發(fā)過(guò)度修復(fù)。Nuclearfactor-erythroid2relate

2、dfactor2(Nrf2)是一種新近發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，它可以啟動(dòng)多種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的活化。在肺纖維化的發(fā)病過(guò)程中，Nrf2及其下游相關(guān)的基因發(fā)生了什么變化，它與炎癥反應(yīng)和膠原代謝之間的關(guān)系如何，給與藥物干預(yù)后是否能增強(qiáng)Nrf2的轉(zhuǎn)錄激活進(jìn)而上調(diào)肺部抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)以發(fā)揮保護(hù)作用，以及這些變化對(duì)于最終的病理改變起到何種影響都不十分清楚。因此，研究此通路的變化及其調(diào)控作用機(jī)制對(duì)于深入探討肺纖維化的發(fā)病機(jī)理與防治策略具有重

3、要意義。
　　本研究通過(guò)建立博來(lái)霉素誘發(fā)的小鼠肺纖維化模型，測(cè)定肺纖維化過(guò)程中氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)，利用RT-PCR和WesternBlot技術(shù)觀察Nrf2及抗氧化酶CAT、SOD、GCS與HO-1mRNA與蛋白表達(dá)的變化，體外原代培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞，MTT法測(cè)定其活力與膠原分泌情況；通過(guò)加入H2O2、博來(lái)霉素（BLM）和咖啡酸苯乙酯（CAPE），觀察它們單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)L929小鼠胚肺成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成量的影響，熒光免疫細(xì)胞化學(xué)法

4、觀察Nrf2在胞內(nèi)的分布情況，EMSA檢測(cè)其DNA結(jié)合能力，觀察Nrf2及抗氧化酶CAT、SOD、GCS與HO-1mRNA與蛋白表達(dá)的變化，同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成情況；采取常規(guī)藥物地塞米松與抗氧化劑咖啡酸苯乙酯單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)治療，觀察實(shí)驗(yàn)性治療效果，為深入研究肺纖維化的發(fā)病機(jī)理，進(jìn)一步提高臨床療效和健康需要，提供初步的實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。
　　通過(guò)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到：（1）在給予動(dòng)物BLM作用后，肺/體比

5、值升高，肺部纖維化表現(xiàn)明顯，羥脯氨酸含量顯著增加，說(shuō)明肺纖維化動(dòng)物模型制作成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物TBARs升高，抗氧化物質(zhì)GSH減少，而抗氧化酶SOD、CAT活性也逐漸下降，說(shuō)明體內(nèi)存在氧化應(yīng)激。通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，肺組織中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及抗氧化酶的mRNA與蛋白表達(dá)都發(fā)生明顯變化，說(shuō)明這些基因可能調(diào)控著肺部氧化－抗氧化的平衡。另外還發(fā)現(xiàn)，模型動(dòng)物的成纖維細(xì)胞增殖活力比對(duì)照組高，而與膠原代謝相關(guān)的MMP-1/TIMP-1比例也發(fā)

6、生改變，說(shuō)明肺纖維化中存在成纖維細(xì)胞狀態(tài)與功能的改變。（2）在給予體外培養(yǎng)的L929成纖維細(xì)胞低劑量的氧化劑BLM與H2O2時(shí)，都可刺激細(xì)胞增殖并且膠原分泌增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，BLM與H2O2均可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的Nrf2mRNA的表達(dá)，但BLM對(duì)Nrf2的蛋白與活性下調(diào)，H2O2對(duì)Nrf2的蛋白表達(dá)與活性仍然顯示出上調(diào)作用。細(xì)胞內(nèi)的重要抗氧化酶CAT、SOD、γ-GCS、HO-1的表達(dá)也發(fā)生變化，且變化趨勢(shì)與Nrf2相似。另外，通過(guò)對(duì)胞內(nèi)氧化應(yīng)

7、激指標(biāo)的觀察發(fā)現(xiàn)，BLM與H2O2引起脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物TBARs的含量增加，CAT、SOD的活性下降，GSH含量降低。給予抗氧化劑，能夠上調(diào)Nrf2的表達(dá)，影響抗氧化酶表達(dá)發(fā)生變化，并提示可能存在劑量效應(yīng)關(guān)系，能夠改善BLM與H2O2所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的狀態(tài)，同時(shí)細(xì)胞的增殖活力與膠原分泌也得到抑制。另外，通過(guò)RNA干涉沉默Nrf2基因后，發(fā)現(xiàn)幾種抗氧化酶對(duì)藥物的敏感性均明顯減弱，說(shuō)明Nrf2是其表達(dá)與活性的核心因子。（3）Nrf2及抗氧化酶

8、的表達(dá)變化與H2O2的濃度有一定關(guān)聯(lián)，氧化劑與抗氧化劑都會(huì)影響胞內(nèi)的H2O2濃度，CAT變化的不一致提示Nrf2與H2O2存在反饋調(diào)節(jié)。低濃度的H2O2會(huì)刺激細(xì)胞增殖，令胞內(nèi)氧化－抗氧化狀態(tài)改變。（4）CAPE可以調(diào)控Nrf2與抗氧化酶，控制胞內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)分子H2O2的濃度，改善BLM與H2O2對(duì)成纖維細(xì)胞的刺激作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肺成纖維細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)節(jié)，它對(duì)Nrf2的活化機(jī)制可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。CAPE對(duì)肺纖維化動(dòng)物模型有一定的治療效果。（5

9、）發(fā)現(xiàn)BLM致肺纖維化作用可能存在的新機(jī)制在于其對(duì)Nrf2或抗氧化酶的蛋白毒性。
　　本課題通過(guò)博來(lái)霉素誘發(fā)的肺纖維化動(dòng)物模型，初步探討了ROS介導(dǎo)的以Nrf2為核心的抗氧化防御體系對(duì)肺纖維化的調(diào)控機(jī)制，并且取得了一定進(jìn)展。發(fā)現(xiàn)ROS可以通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶的改變影響肺成纖維細(xì)胞的狀態(tài)與功能。H2O2是機(jī)體調(diào)控氧化－抗氧化平衡的關(guān)鍵分子，闡明ROS介導(dǎo)的以Nrf2為核心的抗氧化防御系統(tǒng)的改變是肺纖維化中氧化－抗氧化失衡的