第一部分 白色念珠菌β-1，3-葡聚糖合成酶抑制劑篩選模型的建立及研究第二部分 白色念珠菌β-1，3-葡聚糖合成酶調(diào)節(jié)亞基CaRho的克隆表達(dá).pdf

1、真菌感染尤其是深部真菌感染的頻率和嚴(yán)重性急劇的增加，尋找治療深部真菌感染的藥物十分迫切。細(xì)胞壁是低等真核生物所特有而哺乳動(dòng)物中不存在的細(xì)胞組分，對(duì)真菌的存活至關(guān)重要。β-1，3-葡聚糖(β-1,3-glucan)是細(xì)胞壁中含量最多并且最重要的成分，無(wú)論它們?cè)跀?shù)量或質(zhì)量上發(fā)生變化都會(huì)對(duì)真菌細(xì)胞產(chǎn)生致命的影響。β-1,3-葡聚糖合成酶(β-1,3-glucansynthase)存在于細(xì)胞膜中，催化β-1,3-葡聚糖的合成，是真菌細(xì)胞壁合成的

2、最重要的酶之一。抑制β-1,3-葡聚糖合成酶，將抑制真菌的生長(zhǎng)繁殖。因此葡聚糖合成酶是理想的抗真菌藥物的作用靶點(diǎn)，以此為靶點(diǎn)的藥物可以避免細(xì)胞毒性，并且與多烯類和唑類等抗真菌藥物不產(chǎn)生交叉耐藥。 本研究從白色念珠菌ATCC10231培養(yǎng)液中提取了葡聚糖合成酶蛋白，確立了葡聚糖合成酶活性的測(cè)定方法，初步建立了以β-1,3-葡聚糖合成酶為靶點(diǎn)的抗真菌藥物篩選模型，并且用此模型對(duì)本所的3200個(gè)微生物發(fā)酵液樣品進(jìn)行了篩選，從細(xì)胞水平篩

3、選可以抑制白色念珠菌的微生物發(fā)酵液樣品，得到抑制率大于80％的陽(yáng)性樣品112個(gè)，篩選陽(yáng)性率為3.5％。運(yùn)用所建立的β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑篩選模型對(duì)那112個(gè)發(fā)酵液樣品進(jìn)行篩選，得到抑制率大于80％的陽(yáng)性微生物發(fā)酵液樣品6個(gè)，篩選陽(yáng)性率為5.3％。 β-1，3-葡萄糖聚合體是白色念珠菌細(xì)胞壁中最重要的組成部分，在維持細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度和正常的滲透壓上起著非常重要的作用。β-1，3-葡聚糖合成酶是葡聚糖合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化U

4、DP-葡萄糖聚合成β-1，3-葡聚糖。研究表明：β-1，3-葡聚糖合成酶是由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基兩個(gè)亞基組成。催化亞基是大的膜整合蛋白分子，具有16次跨膜結(jié)構(gòu)，小的GTP結(jié)合蛋白CaRho是葡聚糖合成酶的調(diào)節(jié)亞基。二者共同決定著酶的生物學(xué)功能。任何一個(gè)亞基單獨(dú)存在時(shí)都沒(méi)有催化活性，只有把兩種成分聚合時(shí)才可以發(fā)揮葡聚糖合成酶的活性。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)的方法，克隆表達(dá)β-1，3-葡萄糖合成酶的調(diào)節(jié)亞基，為建立以調(diào)節(jié)亞基為靶點(diǎn)的抗真菌藥物篩選

5、模型奠定基礎(chǔ)。 我們以白色念珠菌ATCC10231提取的DNA為模板，應(yīng)用PCR方法得到CaRho基因編碼的DNA片斷，克隆至pGEM-T載體，構(gòu)建了pT-CaRho，對(duì)pT-CaRho測(cè)序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的完全相同。再將此片段克隆至巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)載體PPIC9k中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K-CaRho。SalI線性化重組表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化線性的PPIC9K-CaRh