HIF-1α對(duì)低氧人肺腺癌細(xì)胞COX-2和E-cadherin表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，惡性度高，尤其肺腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生早，對(duì)放化療不敏感，預(yù)后差。研究發(fā)現(xiàn)低氧與肺癌的生存、轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后明顯相關(guān)。腫瘤為適應(yīng)低氧發(fā)生一系列生物學(xué)改變，低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-induciblefactor1α,HIF-1α)是促進(jìn)這一系列改變的關(guān)鍵調(diào)控因子。腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)HIF-1α對(duì)其下游基因進(jìn)行調(diào)控以適應(yīng)低氧環(huán)境，促進(jìn)生長轉(zhuǎn)移。近期研究表明環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2

2、)和上皮鈣粘蛋白(Epithelialcadherin,E-cadherin)在惡性腫瘤的異常表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧有關(guān)。COX-2及其代謝產(chǎn)物前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)常氧條件下PGE2對(duì)肺腺癌細(xì)胞HIF-1α具有誘導(dǎo)作用。E-cadherin是保持上皮細(xì)胞之間的粘附性維持正常組織結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，其失活機(jī)制的研究較多，近期低氧與其的內(nèi)在聯(lián)系研究成為熱點(diǎn)。本研究從肺腺癌適

3、應(yīng)低氧的機(jī)制角度出發(fā)，擬分三部分探討低氧條件下的肺腺癌細(xì)胞是否存在HIF-1α與COX-2/PGE2、E-cadherin內(nèi)在關(guān)聯(lián)及相互調(diào)節(jié)機(jī)制，為肺癌的靶向治療提供理論依據(jù)。 一、HIF-1α、COX-2和E-cadherin在肺腺癌的表達(dá)及臨床意義 目的：探討HIF-1α、COX-2和E-cadherin三項(xiàng)指標(biāo)在肺腺癌組織中表達(dá)的臨床意義及其內(nèi)在聯(lián)系。方法：采用二步法免疫組化檢測(cè)HIF-1α、COX-2和E-cad

4、herin在45例肺腺癌手術(shù)切除標(biāo)本和10例正常肺組織中的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：10例正常肺組織HIF-1α和COX-2表達(dá)均為陰性，E-cadherin表達(dá)均為陽性。三項(xiàng)指標(biāo)在肺腺癌中均較正常組織表達(dá)異常。其中HIF-1α與COX-2為高表達(dá)，E-cadherin為表達(dá)下降，其陽性表達(dá)率為60％、40％和48.9％。HIF-1α的表達(dá)與肺腺癌的分化、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無關(guān)(x2=2.92,P>0.05)；(x2=3.4,P>0

5、.05)；(x2=1.2,P>0.05)。與腫瘤大小有關(guān)(x2=4.85,P<0.05)，腫瘤直徑>2cm組HIF-1α明顯高于<=2cm組。COX-2的表達(dá)在肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組明顯高于陰性組(x2=10.0,P<0.05)，且與臨床分期有關(guān)(x2=9.34,P<0.05)，II期和III期組表達(dá)明顯高于I期組。COX-2表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)(x2=6.84,P<0.05)，腫瘤直徑>2cm組明顯高于<=2cm組。COX-2的表達(dá)與分

6、化程度無關(guān)(x2=0.16,P>0.05)。E-cadherin的蛋白表達(dá)隨著肺腺癌分化程度的降低下降(x2=7.15,P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移陽性組表達(dá)明顯減低(P<0.05)，與臨床分期無關(guān)(x2=2.45，P>0.05)。E-cadherin蛋白表達(dá)與腫瘤大小無關(guān)(x2=2.07，P>0.05)。肺腺癌COX-2蛋白表達(dá)與HIF-1α高表達(dá)有關(guān)(x2=3.95，P<0.05)，而E-cadherin的蛋白表達(dá)與HIF-1α表

7、達(dá)無關(guān)(x2=0.24，P>0.05)。結(jié)論：HIF-1、COX-2和E-cadherin的表達(dá)與肺腺癌的生存、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，HIF-1α在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，HIF-1α與COX-2之間存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)，低氧可能通過激活HIF-1α誘導(dǎo)COX-2表達(dá)使肺腺癌細(xì)胞適應(yīng)低氧，促進(jìn)生存轉(zhuǎn)移。 二、低氧誘導(dǎo)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549HIF-1α、COX-2和E-cadherin表達(dá)的影響 目的：探討低氧誘導(dǎo)和HIF-1α抑

8、制劑YC-1對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549HIF-1α、COX-2和E-cadherin表達(dá)的影響，揭示HIF-1α與COX-2、E-cadherin的內(nèi)在聯(lián)系。方法：首先采用低氧培養(yǎng)箱(5％CO2、1％O2、94％N2、37℃)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行低氧誘導(dǎo)，Westernblot檢測(cè)HIF-1α的蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)COX-2和E-cadherinmRNA的表達(dá)。在確定低氧誘導(dǎo)對(duì)三項(xiàng)指標(biāo)的影響后，加用HIF-1α抑制劑

9、YC-1后進(jìn)行低氧誘導(dǎo)16小時(shí)，檢測(cè)HIF-1α蛋白、COX-2和E-cadherinmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果：常氧條件下未見HIF-1α蛋白的表達(dá)，低氧條件下可見HIF-1α的表達(dá)，低氧8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)分別為0.67±0.04、1.45±0.09、O.77±0.09，組間具有顯著差異(F=243.9，P<0.01)，在低氧16小時(shí)達(dá)到最大值，與低氧8小時(shí)組、低氧24小時(shí)組之間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

10、1)。HIF-1α抑制劑YC-1能明顯抑制低氧對(duì)HIF-1α的誘導(dǎo)，加用濃度為10μM、100μMYC-1，HIF-1α蛋白表達(dá)分別為0.51±0.06、0.06±0.03，與單純低氧16小時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)比較具有顯著性差異(F=441.1，P<0，01)。加用YC-1后HIF-1α蛋白表達(dá)呈濃度依賴性下降。常氧組、低氧8小時(shí)組、16小時(shí)組、24小時(shí)組COX-2mRNA表達(dá)量分別為7.7±1.5％、25.3±7.7％、65.3±1

11、2％、55.0±14.3％，4組間具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=28.9，P<0.01)，低氧誘導(dǎo)16小時(shí)COX-2mRNA高于常氧條件下的8倍(P<0.05)。加入YC-1后COX-2mRNA量呈濃度依賴下降(F=37.1，P<0.01)。常氧組、低氧8小時(shí)組、低氧16小時(shí)組、低氧24小時(shí)組E-cadherinmRNA表達(dá)量分別為47±14.8％、36.6±12.5％、18.7±4.0％、15.7±10.3％，4組間具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=

12、26.5，P<0.01)，組間比較顯示，低氧誘導(dǎo)16小時(shí)E-cadherinmRNA較常氧下降1.5倍(P<0.05)。YC-1對(duì)低氧誘導(dǎo)的E-cadherinmRNA表達(dá)下調(diào)無明顯影響，低氧組、低氧加YC-110μM組、低氧加YC-1100μM組E-cadherin表達(dá)的量分別是18.7±4％、15.3±3.8％、17.0±4.0％，三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.54，P>0.05)。結(jié)論：低氧誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)上調(diào)

13、，低氧條件下COX-2mRNA的上調(diào)與HIF-1α蛋白的上調(diào)有明顯的內(nèi)在聯(lián)系，提示COX-2作為HIF-1α的靶向基因通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)適應(yīng)低氧。E-cadherin在低氧肺腺癌細(xì)胞的上調(diào)可能與HIF-1α的作用無關(guān)。YC-1作為HIF-1α的抑制劑在肺腺癌中具有同樣作用，為今后的肺癌靶向治療提供理論依據(jù)。 三、低氧人肺腺癌A549細(xì)胞PGE2含量變化及對(duì)HIF-1α誘導(dǎo)作用的研究 目的：探討COX-2代謝產(chǎn)物PGE2和選擇性

14、COX-2抑制劑NS398對(duì)低氧A549細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響。方法：采用ELISA試劑盒檢測(cè)低氧誘導(dǎo)16小時(shí)人肺腺癌A549細(xì)胞PGE2含量變化，同時(shí)檢測(cè)了加用不同濃度(10μM、100μM)選擇性COX-2抑制劑NS398后持續(xù)低氧16小時(shí)PGE2含量的變化。采用Wesernblot檢測(cè)外源性PGE2對(duì)常氧和低氧條件下HIF-1α蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)檢測(cè)了加用不同濃度(10uM、100uM)選擇性COX-2抑制劑NS398后

15、持續(xù)低氧16小時(shí)對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：低氧誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)上清PGE2的含量(0.35±0.05ng/ml)明顯高于常氧培養(yǎng)(0.22±0.03ng/ml)(t=5.6，P<0.01)，加用NS398可明顯降低低氧條件下PGE2的升高，且隨著NS398濃度的升高PGE2下降明顯(F=20.3，P<0.01)。常氧對(duì)照組HIF-1α未見表達(dá)，常氧加用PGE2100μM組HIF-1α蛋白表達(dá)為1.14±0.1，較常氧組明顯增高。

16、低氧組與低氧加PGE2組HIF-1α蛋白表達(dá)分別為1.45±0.09、2.31±0.27，二者具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t＝5.25，P<0.01)。低氧組、低氧加NS39810μM組和低氧加NS398100μM組HIF-1α蛋白表達(dá)分別為1.45±0.09、0.72±0.12、0.29±0.09，3組間具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=212.3，P<0.01)，且HIF-1α蛋白量的下降與NS398呈濃度依賴性，隨著NS398濃度的增高，HIF