沙棘弗蘭克氏和非弗蘭克氏放線菌的分離、培養(yǎng)及分子鑒定.pdf

1、沙棘(Hippophae rhamnoides L.)屬胡頹子科沙棘屬植物，是我國(guó)北方半干旱地區(qū)的先鋒樹(shù)種，因其能與弗蘭克氏菌（Frankia）共生在根部形成固氮根瘤，能將大氣中分子態(tài)的氮還原成氨供植物吸收利用，能在瘠薄土壤和較惡劣的環(huán)境中生長(zhǎng)，是改良土壤、治理水土流失、改善生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良生態(tài)經(jīng)濟(jì)型樹(shù)種。并且，沙棘的果、葉和種子中含有大量的營(yíng)養(yǎng)成分和對(duì)人體有重要意義的生物活性物質(zhì)。
　　為了更好的開(kāi)發(fā)利用沙棘共生固氮特性，本論文對(duì)

2、沙棘根瘤弗蘭克氏菌的分離培養(yǎng)條件及其系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行了初步的研究，主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）沙棘根瘤弗蘭克氏菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。采集不同生態(tài)環(huán)境不同沙棘品種的根瘤，從根瘤內(nèi)直接擴(kuò)增DNA，共得到39條根瘤內(nèi)生菌的16SrDNA序列，屬于20個(gè)單倍型，其中磴口沙棘根瘤內(nèi)生菌的16SrDNA序列有19條，屬于4個(gè)單倍型，孫吳的根瘤內(nèi)生菌的16SrDNA序列有20條，屬于16個(gè)單倍型，兩個(gè)地區(qū)間的根瘤內(nèi)生菌沒(méi)有共享的單倍型，不存在基

3、因交流?；诨驇?kù)中下載的和沙棘根瘤擴(kuò)增的16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將不同地域、不同宿主來(lái)源的弗蘭克氏菌分為4個(gè)明顯的分支，包括胡頹子侵染組、楊梅-木麻黃-赤楊侵染組、非典型菌株和未獲得純培養(yǎng)的根瘤弗蘭克氏菌組。其中來(lái)自沙棘根瘤的內(nèi)生菌以52％的支持率全部聚在了胡頹子侵染組，均屬于弗蘭克氏菌。
　?。?）沙棘根瘤內(nèi)生菌的分離、培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選取新鮮幼嫩的沙棘根瘤，采用BAP培養(yǎng)基和QMOD培養(yǎng)基，經(jīng)根瘤勻漿法和切片法從表面消毒

4、的根瘤中分離根瘤內(nèi)生菌，經(jīng)純化得到18個(gè)純培養(yǎng)菌株，其中通過(guò)切片法分離到14株，勻漿法得到4株。研究發(fā)現(xiàn)，根瘤切片法、BAP培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)的方式更適合沙棘根瘤內(nèi)生菌的分離，液體培養(yǎng)能有效的分離菌株，菌落出現(xiàn)時(shí)間比固體分離早7-10天左右。
　?。?）沙棘根瘤純培養(yǎng)菌株的形態(tài)特征和分子鑒定。從沙棘根瘤中分離的18株純培養(yǎng)菌株除了JYY61、JYY62，其余都具有發(fā)達(dá)的氣生菌絲，在顯微鏡下所有菌株都有分支狀的菌絲，但沒(méi)有弗蘭克氏菌典

5、型的泡囊及孢子囊結(jié)構(gòu)，均不屬于弗蘭克氏放線菌。根據(jù)基內(nèi)菌絲和氣生菌絲發(fā)育情況、菌絲與培養(yǎng)基結(jié)合程度、液體培養(yǎng)是否產(chǎn)生菌膜以及菌絲有無(wú)隔膜、孢子分化等形態(tài)培養(yǎng)特征，將來(lái)自沙棘根瘤的18個(gè)菌株分為兩類，并初步判定第一類菌株屬于諾卡氏菌屬（Nocardia），第二類菌株屬于小單孢菌屬（Micromonospora）?；诰W(wǎng)上下載和實(shí)驗(yàn)得到的16SrDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（NJ樹(shù)和MP樹(shù)），18株非弗蘭克氏放線菌被分為明顯的兩個(gè)分支，分