力刺激對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中COX-2-PGE2表達(dá)及細(xì)胞增殖調(diào)控研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)炎癥和滑膜組織超常增生為主要表現(xiàn)的慢性全身性自體免疫性疾病。由于病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)理至今尚未被完全確定。在RA中，成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs)是增生的滑膜組織中最主要的組成細(xì)胞之一，長(zhǎng)期處于炎性激活狀態(tài)，能夠在快速增殖的同時(shí)通過分泌多種炎癥介質(zhì)和基質(zhì)降解酶侵蝕和破壞臨近的軟骨和骨，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，甚

2、至殘廢。關(guān)節(jié)是人體最主要的受力器官之一，但在RA病理研究中，力學(xué)因素對(duì)RA疾病發(fā)展的影響卻常常被人們忽視。本課題組之前的研究已發(fā)現(xiàn)靜態(tài)力學(xué)刺激顯著降低了RA FLSs中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmatalloproteinases，MMPs)的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本文從炎癥和增殖兩方面進(jìn)一步考察了生理水平周期性力學(xué)刺激(6％，1Hz)對(duì)人RA FLSs中炎癥介質(zhì)前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的釋放和細(xì)胞增殖的

3、調(diào)控作用。主要的研究工作和結(jié)果如下：
　　 ①人FLSs的體外原代培養(yǎng)及周期性力刺激對(duì)細(xì)胞形態(tài)與骨架的影響
　　 從手術(shù)中取得人正常或RA的滑膜組織，采用組織塊培養(yǎng)法分離獲得FLSs，建立了后續(xù)實(shí)驗(yàn)必需的滑膜細(xì)胞庫(kù)。利用可控的FX-4000T細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)，對(duì)體外培養(yǎng)的正常和RA FLSs進(jìn)行6％的等雙軸周期性力學(xué)刺激，再進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并對(duì)RA FLSs進(jìn)行F-actin骨架染色。結(jié)果顯示，力學(xué)刺激并未對(duì)細(xì)胞造成物理?yè)p

4、傷；加載后RA FLSs細(xì)胞骨架發(fā)生重排，表明細(xì)胞已經(jīng)受到力學(xué)刺激并作出響應(yīng)，進(jìn)而可能影響細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)調(diào)節(jié)，為本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展奠定了基礎(chǔ)。
　　 ②周期性力刺激對(duì)RA FLSs中PGE2釋放和COX-2表達(dá)的影響
　　 PGE2是RA滑膜中最重要的炎癥介質(zhì)之一，主要參與關(guān)節(jié)中軟骨和骨的破壞，COX-2(cyclooxygenase-2)是其上游調(diào)節(jié)酶。我們?cè)谘装Y因子(IL-1β)刺激下，對(duì)RA FLSs進(jìn)行6％的周期性

5、力學(xué)加載，然后檢測(cè)培養(yǎng)液中的PGE2水平和細(xì)胞中COX-2和MMP-1的表達(dá)變化，并進(jìn)一步檢測(cè)NF-κB信號(hào)抑制劑--IκB-α和IκB-β的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，6％周期性力刺激抑制了RAFLSs中IL-1β誘導(dǎo)的MMP-1和COX-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了PGE2的釋放水平，這表明生理水平的力學(xué)環(huán)境在緩解RA滑膜炎癥過程中起著積極的調(diào)控作用；進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，6％周期性力學(xué)刺激能阻止RA FLSs細(xì)胞質(zhì)中IL-1β誘導(dǎo)的IκB-α和I

6、κB-β的蛋白降解，從而維持IκB-α和IκB-β在細(xì)胞質(zhì)中的蛋白水平，提示力學(xué)刺激可能是通過阻斷NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來下調(diào)RA FLSs中的炎癥響應(yīng)。
　　 ③周期性力刺激對(duì)RA FLSs增殖的影響
　　 除了持續(xù)的炎癥反應(yīng)，RA造成軟骨和骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞的另一重要原因是滑膜組織的超常增生。我們對(duì)RA FLSs分別進(jìn)行2h，6h，12h的6％周期性力學(xué)刺激，通過MTS和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞增殖的變化，同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞

7、周期正調(diào)控因子CDK-2、CyclinD1、CyclinE1和負(fù)調(diào)控因子P27的mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，6％周期性力學(xué)刺激在2h，6h，12h均顯著降低了RA FLSs的增殖速率，表明生理水平的力學(xué)環(huán)境對(duì)緩解RA滑膜超常增生是有利的；6％周期性力學(xué)刺激下RA FLSs中CDK-2和Cyclin E1的mRNA水平明顯下降，P27的mRNA水平明顯升高，而Cyclin D1無明顯變化，說明力學(xué)刺激可能是通過抑制RA FLSs細(xì)胞

8、從G1期向S期的轉(zhuǎn)化來下調(diào)RA FLSs增殖速率的。
　　 ④RA和正常FLSs響應(yīng)周期性力刺激的對(duì)比研究
　　 為進(jìn)一步明確力學(xué)因素對(duì)RA FLSs炎癥和增殖的特異性調(diào)控作用，同時(shí)考察RA關(guān)節(jié)液中高水平的PGE2是否介入RA滑膜的增生，我們對(duì)RA和正常FLSs在力學(xué)刺激下的炎癥和增殖響應(yīng)作了對(duì)比研究，并檢測(cè)了不同濃度的外源性PGE2對(duì)FLSs增殖的影響。結(jié)果顯示，6％周期性力學(xué)刺激只抑制RA FLSs的增殖，對(duì)正常FL

9、Ss的增殖速率沒有影響；細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示加載后RA和正常FLSs中凋亡細(xì)胞的數(shù)量都沒有增加，說明力學(xué)刺激對(duì)RA FLSs增殖的下調(diào)作用并不依賴于細(xì)胞凋亡途徑；在RA FLSs中，6％周期性力學(xué)刺激抑制IL-1β誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá)和PGE2的釋放，在正常FLSs中卻沒有被觀察到，表明RA FLSs對(duì)力學(xué)刺激的炎癥響應(yīng)可能與其不同于正常FLSs的炎性激活特性相關(guān)；同時(shí)，高濃度(100ng/ml，500ng/ml)的外源性PGE2能促

10、進(jìn)RA FLSs細(xì)胞增殖，提示RA滑液中高水平的PGE2可能參與RA滑膜的增生過程，且在此環(huán)境下，6％周期性力學(xué)刺激對(duì)RA FLSs增殖的下調(diào)作用并不明顯。
　　 ⑤COX-2抑制劑對(duì)周期性力刺激下RA FLSs增殖的影響
　　 利用COX-2選擇性抑制劑--celecoxib抑制RA FLSs中COX-2的表達(dá)進(jìn)而降低內(nèi)源性PGE2的釋放，在此基礎(chǔ)上考察生理水平周期性力學(xué)刺激對(duì)RA FLSs增殖的作用。結(jié)果顯示：在細(xì)胞

11、耐受的條件下，celecoxib本身對(duì)RA FLSs的增殖沒有影響；抑制COX-2的表達(dá)和PGE2的內(nèi)源性釋放也不影響周期性力學(xué)刺激對(duì)RA FLSs增殖的下調(diào)作用，表明周期性力學(xué)刺激對(duì)RA FLSs增殖的下調(diào)作用并非通過抑制COX-2的表達(dá)及其下游PGE2的分泌來實(shí)現(xiàn)的。
　　 本文將生物力學(xué)的研究方法引入類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎這一免疫性疾病的病理研究中，為確立該疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制提供了一種新的研究思路。我們的研究結(jié)果證明，通過適當(dāng)?shù)?/p>