胃癌血管生成分子探針的構(gòu)建及活體MR成像研究.pdf

1、【背景】
　　絕大多數(shù)惡性實(shí)體腫瘤都具有血管依賴性。在其生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,新生血管生成起著至關(guān)重要的作用。在腫瘤微環(huán)境的影響下,腫瘤血管在形態(tài)、功能、蛋白表達(dá)、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)性,以及在遺傳學(xué)水平上與正常血管存在差異。以解剖學(xué)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)影像模式在腫瘤的早期診斷及療效評(píng)價(jià)方面已難有大的突破。分子影像學(xué)的研究方法以其無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)在腫瘤血管生成研究領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的潛力,有望從血管生成的角度提高對(duì)實(shí)體瘤診斷、分期的敏感性

2、和特異性,并為抗血管生成治療的療效評(píng)價(jià)提供客觀依據(jù)。本課題以胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合肽(GEBP11)為基礎(chǔ),首次構(gòu)建了針對(duì)胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向MR對(duì)比劑,研究其制備,生物學(xué)活性,與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的特異性及毒性等,并研究了在臨床常用的1.5T及3.0T場(chǎng)強(qiáng)核磁共振條件下標(biāo)記后細(xì)胞體外成像和荷瘤裸鼠活體內(nèi)成像評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的可行性。
　　【目的】
　　1、探討以 Fe3O4納米顆粒和 GEBP11為基礎(chǔ)合成胃癌血管

3、內(nèi)皮細(xì)胞靶向 MR探針的可行性并鑒定探針改變MR信號(hào)的能力、安全性及特異性;
　　2、通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該探針可用于標(biāo)記胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞并能進(jìn)行MR成像;
　　3、通過(guò)荷人胃癌裸鼠模型的MR成像研究進(jìn)一步探討該探針評(píng)價(jià)胃癌血管生成的可行性。
　　【方法】
　　1、以Fe3O4納米顆粒和GEBP11為基礎(chǔ),構(gòu)建特異性MR探針,首次針對(duì)胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行靶向性的MR成像。用溶膠凝膠法合成Fe3O4納米晶體,測(cè)定其改變

4、MR信號(hào)的能力,明膠包裹后通過(guò)交聯(lián)劑使Fe3O4納米晶體與GEBP11結(jié)合,構(gòu)建胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性MR探針——GEBP11@Fe3O4,測(cè)定固定化效率,并對(duì)小鼠進(jìn)行體內(nèi)急性毒性試驗(yàn),初步了解該探針的急性毒性;構(gòu)建FITC標(biāo)記的短肽及其與Fe3O4納米顆粒的偶聯(lián)物,用于細(xì)胞結(jié)合特異性實(shí)驗(yàn)研究。2、建立了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人胃腺癌SGC7901細(xì)胞體外共培養(yǎng)的模型,鑒定其生物學(xué)活性,利用MTT法測(cè)定不同濃度GEBP11@Fe3O4探針對(duì)

5、體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的毒性。3、以無(wú)關(guān)短肽URP作對(duì)照,采用免疫熒光技術(shù)、透射電鏡鑒定GEBP11@ Fe3O4 MR探針與胃癌血管結(jié)合的特異性。4、研究GEBP11@Fe3O4 MR探針用于胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性體外成像的可行性,建立不同的MR掃描序列,觀察不同濃度探針標(biāo)記后細(xì)胞的體外MR成像情況,探討合理的標(biāo)記濃度和最敏感的成像序列;5、建立荷胃癌裸鼠模型,經(jīng)尾靜脈注射GEBP11@Fe3O4,觀察其對(duì)裸鼠組織器官及腫瘤MR信號(hào)的影響

6、,探討其用于活體內(nèi)成像評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的可行性。
　　【結(jié)果】
　　1、溶膠凝膠法成功合成Fe3O4納米顆粒,電鏡檢測(cè)其粒徑約20nm,明膠包裹并偶聯(lián)GEBP11后,電鏡檢測(cè)其粒徑約50nm。探針溶液MR掃描在T2*WI及T2WI序列可明顯降低圖像信號(hào),在T1WI序列圖像信號(hào)無(wú)明顯改變,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)了其灰度值的差異。急性毒性試驗(yàn)顯示,注射 GEBP11@Fe3O4小于0.5mg/只未見(jiàn)對(duì)小鼠有明顯影響,該劑量是安全的,1m

7、g/只的劑量組3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡;
　　2、建立了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人胃腺癌 SGC7901細(xì)胞體外共培養(yǎng)的模型,通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)、生長(zhǎng)狀態(tài)觀察、粘附能力比較及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),證實(shí)共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞具有和胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞相似的生物學(xué)特征;四甲基偶氮唑蘭（MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,得出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖,證實(shí)用50μg Fe/ml濃度的GEBP11@Fe3O4標(biāo)記的細(xì)胞,具有與未標(biāo)記細(xì)胞近似的增殖能力。
　　3、免疫熒光染色結(jié)果顯

8、示,孵育約30min至1h,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光,無(wú)關(guān)肽組未見(jiàn)綠色熒光顯示;TEM結(jié)果可見(jiàn)探針標(biāo)記后的細(xì)胞內(nèi)多數(shù)致密電子密度顆粒。
　　4、體外MR成像可見(jiàn)用50μg Fe/ml濃度的GEBP11@Fe3O4標(biāo)記后的內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞濃度大于1.0×105/ml時(shí)可改變MR T2*序列的圖像信號(hào)。
　　5、荷胃癌裸鼠MR顯像結(jié)果,靜脈注射GEBP11@Fe3O4后30min,實(shí)驗(yàn)組荷胃癌裸鼠腫瘤組織 T2*WI信號(hào)較無(wú)關(guān)肽組腫瘤組

9、織略有降低,提示 GEBP11@Fe3O4有望成為檢測(cè)胃癌血管生成的特異性MR探針。
　　【結(jié)論】
　　1、溶膠凝膠法制備的Fe3O4納米顆粒明膠包裹后粒徑約50nm,具有良好的順磁性,偶聯(lián)GEBP11構(gòu)建的胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向MR探針具有改變MR信號(hào)的能力。
　　2、通過(guò)免疫熒光技術(shù)及標(biāo)記后細(xì)胞的體外成像實(shí)驗(yàn)證實(shí),該探針可以與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合,并可明顯降低T2*WI序列MR信號(hào)。
　　3、活體實(shí)驗(yàn)證實(shí)